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二抗偶联物选择指南

一本为您的科学应用选择正确的偶联二抗的有用指南。

二抗可与许多标记物偶联,包括酶、生物素和荧光染料/蛋白。标记物的选择主要取决于所进行的实验应用。

                   免疫检测实验

                   二抗标记物

ELISA

酶(通常是 HRP 或 AP)、生物素

免疫荧光

荧光标记物、生物素

免疫组织化学

酶、生物素

流式细胞术

荧光标记物、生物素

免疫细胞化学

荧光标记物、生物素

酶 - 是蛋白,它们作用的分子称为底物。酶标记物可在酶组化方法中通过显色反应(即可溶性无色底物转化为不溶于水的有色化合物)显色来达到可视化。

最常用的两种酶是:

辣根过氧化物酶 (HRP) -可通过显色反应,例如二氨基联苯胺 (DAB))或化学发光达到可视化。HRP 是 44 kDa 的糖蛋白酶标记物,比碱性磷酸酶更稳定。

HRP 标记的二抗 

碱性磷酸酶 (AP) -是水解酶,我们通常可通过比色底物 pNNP 测量 AP 的信号。

AP 标记的二抗

生物素/链霉亲和素 - 当靶标的表达水平太低,不能仅靠二抗标记的抗体检测时,通常使用生物素/链霉亲和素。许多生物素分子可偶联至二抗,而链霉亲和素对生物素的高亲和性提供了额外的优势。通过这一放大步骤,并且通过将链霉亲和素结合于标记物(例如 HRP 或荧光探针),低表达水平的蛋白可更容易被检测。在检测中,研究人员通常先加入生物素标记的二抗,然后加入链霉亲和素偶联的标记物(例如 HRP)。

生物素标记的二抗.


荧光偶联二抗- 对于多色分析,科学家倾向于使用与荧光标记物偶联的二抗。由于其独特的电子构型,这些荧光标记物具有特征性吸收和发射光谱,即单个染料在特定波长被激发,并在另一波长发射光子。此外,串联染料则由供体和受体荧光素分子组成,两种分子的位置非常靠近,使二者之间可发生能量转移。串联染料在供体分子的激发波长处被激发,并以受体分子的发射波长发射光子。

需要特别提出的是,我们现在提供一系列 Alexa fluor® 偶联物,这类偶联物是多色分析的理想选择,覆盖从 UV 到远红外的整个光谱。不仅如此,我们还提供了多种物种的Alexa fluor® 染料偶联二抗,并且许多偶联二抗都已经经过预吸附处理,可确保低交叉反应性。


选择荧光偶联二抗的考虑事项

下表列出了我们提供的荧光标记二抗产品。为方便您查看,我们也提供最大吸收波长、最大发射波长和消光系数。


多色分析的荧光标记二抗的选择技巧:

·         选择适合您的仪器的最亮的荧光染料组合

·         荧光光谱的重叠度可以通过选择正确的荧光标记物尽可能减少

·         确保将最亮的标记物和表达水平最低的蛋白组合,反之亦然。

·         使用二抗时,检查并确保一抗来源于不同的物种,以避免二抗的交叉标记。注意,我们提供针对同一物种的不同亚型的二抗(小鼠 IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3 等),为您提供更多选择。当然,您必须使用相应亚型的一抗。

·         多色分析中通常使用预吸附的二抗,以确保不同物种之间的交叉反应最小。

·         有时候样品的自发荧光会产生问题,您在选择二抗偶联物时必须考虑这点。例如,肝切片在红色通道中发出自发荧光,因此,在对此类组织类进行染色时,应避免使用在红色通道中发光的标记物。


标记物

最大吸收波长 (nm)

最大发射波长 (nm)

消光系数

Alexa Fluor® 405

402

421

35,000

AMCA

346

442

19,000

Cy2

489

506

150,000

DyLight® 488

493

518

70,000

Alexa Fluor® 488

495

519

73,000

FITC

494

520

70,000

Alexa Fluor® 555

555

565

155,000

Cy3

550

570

150,000

PE

488

575

1,960,000

TRITC

557

576

100,000

DyLight® 550

562

576

150,000

Rhodamine

544

576

80,000

TAMRA

557

583

203,000

Cy3.5

576

589

150,000

Alexa Fluor® 568

578

603

88,000

PE/Texas Red®

535

615

-

Texas Red®

595

615

85,000

Alexa Fluor® 594

590

617

92,000

DyLight® 594

593

658

80,000

APC

650

662

700,000

Cy5

643

667

250,000

Alexa Fluor® 647

650

668

270,000

PE/Cy7

488

670

-

DyLight® 650

652

672

250,000

Cy5.5

675

694

190,000

PE/Cy5.5

535

694

-

Alexa Fluor® 680

679

702

183,000

Alexa Fluor® 750

749

775

290,000

APC/Cy7

633

776

-

Alexa Fluor® 790

784

814

260,000


Alexa Fluor® 和 Texas Red 是 Life Technologies 的注册商标。Alexa Fluor® 染料偶联物包含由 Life Technologies 授权给 Abcam 的技术。DyLight® 是 Thermo Fisher Scientific Inc 及其子公司的注册商标。


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