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蛋白质印迹(Western blot)疑难解答和建议

这些疑难解答提示可帮助您解决蛋白质印迹问题,包括无信号、高背景、多条带等问题的常见原因。

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打印蛋白质印迹疑难解答提示。


无信号

一抗和二抗不相容

使用针对一抗来源物种产生的二抗(例如,一抗来源于兔,使用抗兔二抗)。

结合到目标蛋白的一抗或二抗不足

使用更高浓度的抗体,或在 4 ℃ 下孵育更长时间(例如过夜孵育)。

封闭剂和一抗或二抗之间发生交叉反应

使用温和去垢剂,例如 Tween 20,或更换封闭剂(常用的封闭剂是牛奶、BSA、血清或明胶)。

一抗不识别测试物种中的蛋白

查看数据表或进行 BLASTp 比对,检查抗体是否应与目标蛋白反应。运行推荐的阳性对照。

抗原不足

每个泳道上样至少 20–30 μg 蛋白,使用蛋白酶抑制剂,并运行推荐的阳性对照。

组织中目标蛋白丰度不够

利用富集步骤使信号达到最大(例如,对于核蛋白,制备核裂解物)。

蛋白转膜效果差

用可逆染料(例如丽春红)检查转膜情况。如果蛋白未有效转膜,检查转膜方向是否正确。如果使用 PVDF 膜,确保先将膜预浸在甲醇中,然后预浸在转膜缓冲液中。

膜洗涤过度

减少洗涤步骤的数量或缩短洗涤步骤的时间。

一抗使用过多

使用新配制的一抗,因为每次使用后有效浓度会降低。

二抗被叠氮化钠抑制

不要同时使用叠氮化钠和 HRP 偶联抗体。

检测试剂盒陈旧,底物无活性

使用新配制的底物。




背景偏高

​​可能未封闭非特异性结合,或封闭不充分

延长封闭孵育时间,考虑更换封闭剂,我们推荐使用 3-5% 脱脂奶粉、BSA 或正常血清在室温下孵育 1 小时。也可将这些封闭剂加在抗体缓冲液中。

一抗浓度可能过高

将抗体滴定至最佳浓度。延长孵育时间,但增加抗体稀释度(缓慢但定向的结合是最好的)。

孵育温度可能过高

在 4 ℃ 下孵育膜。

二抗可能与封闭剂非特异性结合或反应

运行不含一抗的二抗对照。

封闭剂和一抗或二抗之间发生交叉反应

向孵育和洗涤缓冲液中加入温和去垢剂,例如 Tween 20。

对于磷酸特异性抗体:牛奶含有酪蛋白,酪蛋白是磷酸化蛋白;磷酸特异性抗体将检测牛奶中的酪蛋白,从而导致高背景。使用 BSA 代替牛奶作为封闭剂。

未结合抗体的洗涤不充分

增加洗涤次数和延长洗涤时间。

您选择的膜可能产生高背景

硝化纤维膜被认为背景比 PVDF 低。

膜变干。

应注意避免膜在孵育期间变干



多条带

频繁传代的细胞系逐渐积累蛋白表达谱差异

返回原始的未传代细胞系,平行运行这些样品。

蛋白样品在体内有多种修饰形式,例如乙酰化、甲基化、十四烷基化、磷酸化、糖基化等

查阅文献,在可能的情况下使用试剂去除修饰,使得蛋白以预期大小运行。

蛋白样品中的靶标被消化(如果条带的分子量较低,这种可能性更大)

确保样品缓冲液中有足够的蛋白酶抑制剂。

检测到未报道的新蛋白或不同的剪接变体,它们具有相似的表位并且可能来源于同一蛋白家族

查阅其它报告文献,进行 BLAST 检索;使用数据表上报道的细胞系或组织。

一抗浓度过高

试着降低一抗浓度。运行二抗对照(不含一抗)。

抗体未经纯化

试着使用亲和纯化的抗体。这通常能除去非特异性条带。

条带可能是非特异的

可能的情况下使用封闭肽来区分特异性和非特异性条带。只有特异性条带会被封闭(从而消失)。

蛋白靶标可能形成多聚体

试着在 Laemmli 缓冲液中煮沸 10 分钟而不是 5 分钟,破坏多聚体。



印迹上有不均匀的白斑

转移时膜上有气泡,或抗体在膜上未均匀分散

确保制备转膜凝胶时除去气泡。一边摇动一边孵育抗体。



印迹上有黑点

抗体结合到封闭剂。

过滤封闭剂。



黑色印迹上有白色条带(与预期印迹相反)

一抗过多和/或二抗过多。

进一步稀释抗体。



分子量标准泳道呈黑色

抗体与分子量标准反应。

在分子量标准和第一个样品泳道之间留一个空白泳道。



印迹上目标条带极低/高

分离无效。

改变凝胶百分比:使用高百分比凝胶分离小蛋白,低百分比凝胶分离大蛋白。



条带上有微笑效应

迁移速度过快。

降低电泳电压。

迁移过热(改变 pH 和变更迁移条件)。

在冷室或冰上电泳。



检测同一蛋白的泳道中条带大小不均匀

制胶时凝胶凝固过快,丙烯酰胺在凝胶中分布不均匀。

查看凝胶配方和向凝胶中加入的 TEMED 量,在迁移凝胶凝固时,在凝胶上方加入一些 0.1% SDS 水溶液,防止凝胶变干。



凝胶染色不均匀

​细菌污染

将抗体保存在 4 ℃ 下,使用新配制的缓冲液覆盖凝胶。

抗体体积不足

确保膜被抗体覆盖,并一边摇动一边孵育。




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