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蛋白质印迹(Western blot)常见问题

蛋白质印迹常见问题。

为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同?

蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲,蛋白质越小,在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响,因此,观察到的实际条带大小可能与预测的不同。常见的因素包括:

1.       翻译后修饰 - 例如磷酸化、糖基化等,可增加蛋白质大小。

2.       翻译后切割 - 例如,许多蛋白先被合成为前蛋白,然后被切割产生活性形式,例如前半胱天冬酶。

3.       剪接变体和异形体 - 可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。

4.       相对电荷-氨基酸(带电和不带电)多聚体组分,例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止,但强相互作用会导致较大的条带出现。

应该上样多少样品?

细胞裂解物、膜裂解物和核裂解物:每孔上样 20 至 30 µg 总蛋白。

这可能需要根据测试样品中的蛋白质表达水平进行一些优化。纯化蛋白(重组或内源):上样 10 至 100 ng 蛋白。

检测重组蛋白时难以获得条带。为什么?

抗体检测重组蛋白质时,存在难以克服的困难,有必要加以考虑。我们推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。

同时,如果重组蛋白带有标签,标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的 C 或 N 末端,以降低这种情况发生的可能性(而不是位于蛋白质的阅读框中间)。

在蛋白质印迹中检测重组蛋白时,我们始终推荐运行内源阳性对照。

样品需要还原和变性吗?

我们推荐查看数据表获取更多详情。Abcam 抗体将仅在还原和变性条件下进行测试,除非数据表中另有说明,我们推荐使用还原和变性条件。

在一些情况下,Abcam 抗体也将在非还原条件下进行测试,在这种情况下,我们将在数据表上详细说明(参见应用备注部分或 Abreviews)。如果我们有表明抗体在某种或其它条件下无效的数据,数据表会加以说明。

牛奶和 BSA 封闭有区别吗?

抗体可能对封闭剂敏感,我们推荐查看数据表确定是否有数据表明抗体在 BSA 还是牛奶中效果更好。如果有,Abcam 将在数据表中加以说明。

一般来讲,BSA 会产生更清晰的结果,因为 BSA 含有较少的蛋白,因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此,有些抗体在牛奶中的效果更好,因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白,能封闭更多不同类型的蛋白质。

能否用室温下孵育一抗 1 小时代替 4 ℃ 过夜孵育?

蛋白质印迹中一抗孵育时间需要最终用户进行优化。一般来讲,4 ℃ 过夜孵育将产生更高效、更特异的染色。但许多抗体在室温下孵育 1 或 2 小时效果也非常好。

我们推荐查看数据表上关于合适孵育时间的数据(参见可用的Abreviews、出版物和图像数据)。


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