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Staining in paraffin-embedded mouse cerebellum tissues by immunohistochemistry

有关IHC和ICC的疑难解答和对照使用方法

有关IHC 和 ICC 的详细疑难解答提示和技术

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没有染色

一抗和二抗不匹

  •      使用针对一抗来源的种属产生的二抗(例如,一抗来源于兔,使用抗兔的二抗)。确保一抗和二抗的同 种型匹配(例如,IgYIgG)。

结合到目标蛋白的一抗不足

  •    提高抗体的工作浓度,在 4 ℃ 孵育更长时间(例如,过夜孵育)。

抗体可能不适于蛋白以天然状态( 3D 形式)呈现的 IHC

  • ·查看抗体数据表,确认抗体是否经过 IHC 验证,并确认验证的 IHC 类型(福尔马林/PFA 固定、冰冻切片等)。
  •    使用天然(未变性)WB 检测抗体,确保抗体未被破坏。

一抗/二抗/放大试剂盒可能由于储存不当、稀释不当或反复冻融而失活

  • ·使用阳性对照来确保一抗/二抗的有效性(参见第 4 部分了解更多有关对照的信息)。

检测组织中不存在目的蛋白

  • 使用抗体供应商推荐的阳性对照(参见第 4 部分了解更多有关对照的信息)

组织中目标蛋白丰度不够

  • 利用放大步骤将信号最大化。例如,使用生物素偶联二抗和偶联酶的链霉亲和素。

二抗未避光储存(如果检测系统是免疫荧光)。 

  •  始终防止二抗暴露在光下。

脱蜡不充分

  •  延长切片脱蜡时间,使用新配制的二甲苯。

固定过程(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)可能改变了抗体识别的表位

  •  使用不同的抗原修复方法来使表位暴露,包括用 pH 6 或 pH 9 缓冲液的热抗原修复法、酶抗原修复法等。
  •  缩短切片固定时间。

蛋白位于核内,抗体(核蛋白)不能进入细胞核

  •     向封闭缓冲液和抗体稀释缓冲液中加入强透化剂,例如 Triton X。参见我们的透化技术实验方案。

PBS 缓冲液被细菌污染,破坏了目标蛋白上的磷酸基团

  •   在 PBS 抗体储存缓冲液中加入 0.01% 叠氮化物或使用新配制的无菌 PBS。

背景偏高

可能未封闭非特异性结合,或封闭不充分

  • 延长封闭孵育时间,考虑更换封闭剂。Abcam 推荐使用二抗种属来源的 10% 正常血清封闭 1 小时,或使用 1-5% BSA 封闭细胞样本 30 分钟。
  •  另一种选择是用针对样品种属的 Ig 进行预吸附处理的二抗。

一抗浓度可能过高

  • 将抗体滴定到最佳浓度,进一步稀释抗体并在 4 ℃ 下孵育(缓慢但特异地结合是最好的)。

孵育温度可能过高

  •  4 ℃ 下孵育切片或细胞。

二抗可能非特异性结合

  • 使用不加一抗的二抗对照。
  • 如果观察到二抗对照有染色,则更换二抗或使用针对样品种属 Ig 进行预吸附处理的二抗。

组织洗涤不充分,仍含有固定剂

  •   在所有步骤之间用 PBS 充分洗涤。

内源过氧化物酶有活性

  • 使用酶抑制剂,例如用 Levamisol (2mM) 抑制碱性磷酸酶,或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制过氧化物酶。

固定过程(使用福尔马林或多聚甲醛固定剂)引起自发荧光(如果检测系统是免疫荧光)

  • 福尔马林/PFA 通常会在绿光光谱内产生自发荧光,因此试着使用红光范围内的荧光素。
  • 如果有红外检测系统,使用红外区的荧光素。

过度放大(放大技术)

  • 缩短孵育时间,稀释二抗或信号放大试剂盒。

底物过多(酶检测)

  •  ​进一步稀释底物,缩短底物孵育时间。

色原与细胞//组织中的 PBS 反应(酶检测)

  • 在底物孵育切片/细胞前后使用 Tris 缓冲液洗涤切片/细胞透化破坏了细胞膜并去除了膜蛋白(膜蛋白)
  • 使用较温和的去垢剂(例如,用 Tween 20 代替 Triton X)。或去除缓冲液中的透化剂。参见我们的透化技术实验方案。

非特异性染色

一抗/二抗浓度可能过高

  • 试着降低抗体浓度和/或缩短孵育时间。与不表达靶标的细胞或组织上的信号强度进行比较。

内源过氧化物酶有活性

  • 使用酶抑制剂,例如用 Levamisol (2 mM) 抑制碱性磷酸酶,或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制过氧化物酶。

一抗的种属来源与组织样本的种属相同(例如,用小鼠一抗测试小鼠组织)。加入二抗时,二抗会结合样本,因为二抗来源于该种属

  • 使用种属来源不同于样本种属的一抗。或检测系统使用生物素直标一抗和酶偶联的链霉亲和素。

切片/细胞变干

  •   保持切片/细胞高湿度,避免变干。

使用对照

阳性对照

为什么需要阳性对照:
要验证样品染色,需要使用阳性对照。阳性对照是已知表达目的蛋白的细胞系或组织切片。如果阳性对照的结果呈阳性,即使样品呈阴性,也能说明流程的优化性和可行性。阳性结果可证明任何阴性结果的有效性。

如何确定适用作阳性对照的组织类型或细胞系:

  • 首先查看抗体数据表。抗体数据表通常会提供建议的阳性对照。始终确保所用组织或细胞系来源于已测试的物种。
  • 如果抗体数据表未列出阳性对照,我们推荐采取以下措施:
  • 查看是否有关于该抗体的 Abreview。客户成功检测过的任何组织、细胞或裂解物均可视为合适的阳性对照。
  •   试着查看数据表上的 Swiss-Prot 或 Omnigene 数据库链接。这些数据库通常会列出表达该蛋白质的组织。这些组织也可视为合适的阳性对照。
  •   查看该蛋白质的 GeneCards 条目。GeneCard 通常会提供不同组织中的相对表达水平。
  •  在Human Protein Atlas查看该蛋白质。该数据库在不同组织、癌症和细胞系中检测蛋白表达。请访问 www.proteinatlas.org
  • 如果仍然难以找到合适的对照,我们推荐在 PubMed 上快速搜索相关文献,查看哪些组织和细胞表达目标蛋白质。

阴性对照

为什么需要阴性对照:
阴性对照是已知不表达检测蛋白的细胞系或组织切片。使用阴性对照的目的是检查是否存在非特异性结合和假阳性结果。推荐的阴性对照组织是敲低 (KD) 或敲除 (KO) 组织样品。

无一抗对照

  • 无一抗对照是指实验中不加入一抗。无一抗对照可以显示是否存在由于二抗的非特异性结合而造成的非特异性结合或假阳性。
  •  具体方法是用不含抗体的抗体稀释缓冲液对相同样品进行正常的孵育。

同型对照

  • 同型对照与一抗具有相同的同种型(IgG2a、IgY 等)、克隆性、偶联物和宿主物种,但针对的是样品中不存在的分子。通常同型对照是针对化合物或非哺乳动物蛋白质产生的。
  • 同型对照抗体的使用与一抗浓度相同 (µg/ml)。这可以检测样品中的背景。
  • 与无一抗对照步骤相似,在样品孵育抗体时使用同型抗体来替代,然后正常使用二抗。

使用转染细胞系作为对照:我们推荐在检测重组蛋白样本时,加上内源性对照。这应是实验设计的重要部分。

  •  抗体检测重组蛋白质时,可能存在难以克服的困难需要加以考虑:
  •  重组蛋白质的折叠可能与内源蛋白的天然形式有所不同。这种折叠形式可能阻止抗体接近表位。带标签的 重组蛋白尤其如此。
  • 应确保标签位于重组蛋白的 N 或 C 末端。最重要的是,应确保重组蛋白包括所用抗体的免疫原序列
  • 内源性阳性对照对于验证实验结果非常重要,并且可以说明试剂(例如抗体)和实验流程的效果如何


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