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siRNA实验常见问题,优化和疑难解答

siRNA 实验相关的有用信息、链接以及推荐检查和对照

​越来越多的实验室利用 siRNA 敲低技术来评估细胞内蛋白质的功能。这项技术常被用于确定从细胞中去除蛋白质之后所产生的影响:

  • 是否导致细胞死亡?是否为致死敲除?
  • 是否影响其它蛋白质(尤其是信号转导通路中的蛋白质)的表达水平?
  • 是否影响其它蛋白质在细胞中的位置?
  • 对细胞表型、形态和功能产生哪些影响?

siRNA 简介​​

小干扰 RNA (siRNA) 是由 20-25 个核苷酸组成的双链 RNA 分子,在细胞中具有多种功能。在 RNA 干扰 (RNAi) 通路中,siRNA 通过与互补 mRNA 分子杂交干扰基因表达。这种干扰会触发 mRNA 降解,进而抑制特定基因的基因表达。

siRNA 于 1999 年由 David Baulcomb 实验室首次发现。2001 年,Thomas Tuschl 提出合成 siRNA 会在哺乳动物细胞中诱导 RNA 干扰 (RNAi),具体请参见以下论文:

Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001)."Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836):494–498. PubMed 11373684.

如今,专门设计用于与 RNA 靶序列杂交并使其降解的“合成”siRNA 寡核苷酸已被广泛用于诱导细胞 RNAi。靶 mRNA 的降解能够有效“敲除”相应蛋白质的表达。然后可分析靶蛋白浓度降低造成的影响。

作用原理

  1.  利用短寡核苷酸 siRNA 或能够转录 siRNA 的 DNA 质粒将双链 RNA (dsRNA引入细胞。
  2. 细胞中的 Dicer 蛋白将 dsRNA 消化为 21 bp 的 dsRNA (siRNA)。
  3.  siRNA 被整合到 RNA 诱导沉默复合体 (RISC) 中。
  4. 在 RISC 复合体中,dsRNA 发生链分离。其反义链与细胞中的互补/靶 mRNA 杂交。
  5. 活化 RISC 中的核酸酶降解靶 mRNA。
  6. 断裂的 mRNA 无法翻译成蛋白质。也就是说蛋白质无法表达,从而成功“敲除”蛋白质。


优化 siRNA 序列,实现最佳敲除效果

许多在线程序都可帮助您从待敲低蛋白质的 mRNA 序列中选择最合适的 siRNA 序列。
这些计算机程序根据以下标准从蛋白质的完整 mRNA 序列中筛选 21 bp 的序列:

  1. 位于起始密码子 AUG 50-100 个核苷酸范围内的序列,或位于终止密码子 50-100 个核苷酸范围内的序列(确保转录基因为沉默状态)。
  2. siRNA 序列以 AA 开始(以便在反义序列的 3’ 端形成 dTdT 结构),这样可降低合成成本并提高 siRNA 双链体的核酸外切酶活性抗性。
  3. GC 含量:理想的 GC 含量为 < 50%(大多数软件的默认范围为 40% 至 50%)。
  4.  延伸核苷酸重复序列。
    避免使用含有 3 个或 3 个以上重复 G' 或 C' 的序列(
    这种序列会引起分子内二级结构的形成,影响杂交效果)。
  5.   BLAST 检索(避免“脱靶”)

选定靶序列之后,进行 BLAST 检索确保靶序列与其它基因序列不同源。
一般而言,从程序给出的 siRNA 序列中选出 3 个得分最高的序列进行 BLAST 检索,这样得到有效序列的几率较高。
请注意:期刊编辑审稿时通常都会要求作者提供 BLAST 检索信息。
组合使用 — 从 3 个 siRNA 开始,逐步缩小范围,最后锁定其中 1 个。
还可以一次性敲除 2 个以上基因,但首先要分别对其进行优化。

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siRNA 实验推荐对照和检查

以下内容提供了我们建议您在 siRNA 实验中使用的对照样品的信息,还包括设计和进行实验时应检查的相关信息。

细胞系 — 使用已知具有高转染效率的细胞系。
例如 292、海拉细胞、MRC5、U2OS(我们不建议使用原代细胞,因为原代细胞不易转染)。

不含 siRNA 的内源性阳性对照样品。
用作靶蛋白的阳性对照和 siRNA 敲除的阴性对照。应向其中加入除 siRNA 之外的所有试剂,用于检查转染试剂的影响。

利用剂量响应曲线优化 siRNA 寡核苷酸或质粒的用量。
目的在于找出最佳的 siRNA 浓度。既要保证足够的 siRNA 用以实施敲除,又要保证 siRNA 的浓度不会过度活化 RISC 复合体,或导致其它试剂产生毒性。

标签 siRNA — 观察如 GFP 标签的荧光来确认转染效果。
可对加入细胞中的一小部分 siRNA 进行荧光标记(例如 GFP),用以确认转染效果。应只标记全部 siRNA 中的一小部分,其余 siRNA 须保持未标记状态,因为标签会阻碍 RNA 结合。

利用毒性对照检查细胞活力。
由于某些试剂可能具有毒性,需要计算并监测转染毒性。例如,可使用多种细胞染色剂(例如台盼蓝)来检测死亡细胞,通过检查细胞活性达到监测转染毒性的目的。

诱导/未诱导。
如果 siRNA 的表达是通过含有诱导型启动子的质粒进行的,应对已诱导和未诱导的转染样品进行测试。

siRNA 阴性对照(使用含有无义序列/错义序列的 siRNA)。
siRNA 会参与多条其它通路,因此可能触发非特异性效应。
MicroRNA 调控基因表达的主要方式是与靶 mRNA 进行不完全杂交,因此 siRNA 的引入可能导致意外脱靶。

检查 siRNA 序列(计算机程序) — BLAST 检索。
对 siRNA 进行 Blast 检索,确保 siRNA 只与目标蛋白质的相关 mRNA 杂交。

“Mock”对照。
使用另一种蛋白质(例如 GAPDH) siRNA(不含靶蛋白 siRNA)来检查 RISC 信号转导通路是否被激活,同时确认所用 siRNA 不会影响细胞的整体功能。

检查 mRNA 的降解时间以及降解物中的蛋白质。
蛋白质分子越大,蛋白质及其相关 mRNA 的半衰期就越长。您可能需要优化 siRNA 敲低在细胞中生效所需的时间。

回复实验对照。
用重组靶蛋白转染细胞,以重新引入靶蛋白。这是期刊审稿时常要求作者提供的内容。

评估结果 — 使用对照样品(例如阳性对照和阴性对照)。
确保使用相关应用所要求的所有对照来评估结果,包括内源性阳性对照和阴性对照。


评估结果:

RT-PCR
检查是否存在 mRNA。是否仍存在靶 mRNA?或是否敲低成功?
这种方法非常灵敏,但无法准确预测蛋白质水平。

蛋白质印迹实验
可指示是否存在蛋白质。还可使用抗体来检测样品中的多种蛋白质,从而观察靶蛋白敲除对其它蛋白质的影响。

免疫细胞化学法
可指示是否存在敲低蛋白。
其优势在于利用双重染色法,可同时检查敲除对其它蛋白质表达的影响以及其它蛋白质在细胞中的位置。


疑难解答汇总

  1. 您如何选择序列?您是否尝试过多个 siRNA 序列?检查序列是否与蛋白质正确匹配。
  2. 您是否检查过转染效率?是否优化过敲除生效所需的时间?
  3. 您是否利用荧光标签检查过转染效果?是否利用 RT-PCR 检查过敲除效果?
  4. 您使用的内源性阳性对照和阴性对照是否正确?您是否使用了错义 siRNA 对照或标准阴性 siRNA 对照?


资源

·        免费在线 siRNA 设计和 Flash 教程。

·        国家生物技术信息中心提供了生物医学信息和基因组信息的访问入口,您可从中获取所选靶蛋白的 mRNA 或 cDNA 序列。

·        UCSC 基因组网站上的 Blat 工具。


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