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在许多细胞系中,MMP-9表达水平低。但是,当使用PMA(蛋白激酶 C 的一种配体)刺激细胞可以显著诱导 MMP9 表达1。为了检测到细胞系中的 MMP-9信号来进行分析,可能需要首先用 PMA 刺激细胞。
使用 PMA 刺激细胞
该方案针对 U937 细胞进行了优化。
使用含 2 mM 谷氨酰胺和 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI 1640 培养基, 37℃ 培养细胞。
当细胞培养密度达到 0.5-1 x 106 个细胞/mL 时,将 20 mL (2 x 107) 细胞转移至新的培养皿中,并加入 PMA 至终浓度 10 ng/mL。
37℃ 孵育 21 h ,然后加入布雷菲德菌素 A(Brefeldin A)至终浓度3 µg/mL,再孵育 3 h。布雷菲德菌素 A 处理细胞可抑制蛋白分泌。
离心收集细胞,并使用 PBS 清洗。
用液氮速冻细胞。
细胞可在 -80℃ 下保存,或立即裂解进行WB分析。
超声处理,3次40 s,如果细胞团块仍然可见,重复超声处理。裂解液为淡黄色则裂解良好。
离心裂解液,8000 rcf 离心10 min,4°C,沉淀细胞碎片。
转移上清液至新试管中,注意不要转移任何细胞碎片。
裂解液既可以在 -80℃ 下保存,也可以立即用于 WB 分析。
使用前加入蛋白酶抑制剂。
NaCl | 150 mM |
NP-40 或 Triton X-100 | 1.0% |
脱氧胆酸钠 | 0.5% |
十二烷基硫酸钠(SDS) | 0.1% |
Tris, pH 8.0 | 50 mM |
参考文献
Roomi MW, Monterrey JC, Kalinovsky T, Rath M, Niedzwiecki A. Patterns of MMP-2 and MMP-9 expression in human cancer cell lines.Oncol Rep. 21, 1323-1333 (2009).