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间标流式细胞术实验方案

使用一抗和偶联二抗的流式细胞术一般程序。

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间接标记需要两个孵育步骤,首先用一抗孵育,然后再用相应的二抗孵育。二抗(而非一抗)偶联荧光染料(FITC、PE、Cy5®​ 等)。请注意,该方案仅为通用实验方案,您可能需要根据具体的应用进行调整。

一般程序:

1.       收集并洗涤细胞,然后测定细胞总数。

通常在12 x 75 mm2 大小的聚苯乙烯圆底Falcon离心管中对细胞进行染色。但是,若有合适的离心设备,细胞染色可在任何容器中进行,例如试管、微量离心管和 96 孔圆底微量滴定板。一般说来,应该尽可能地加快离心速度,保证去除上清液时的细胞损失较小,但是如果离心速度过快会导致细胞难以重悬。

通常需要检查细胞活力是否在 95% 左右且不低于 90%。

2.       在含 10% FCS、1% 叠氮化钠的冰冷 PBS 溶液中重悬细胞至约 1-5 x 106 细胞/mL。



请使用冰冷的试剂/溶液,并且将细胞保存在 4 ℃ 的低温环境下,因为低温和叠氮化钠的存在可以抑制表面抗原的调节和内化作用,避免了荧光强度的降低。


3.       向每根离心管中添加 100 μl 细胞悬液。

4.       添加 0.1-10 μg/mL 的一抗。如有必要,应使用 3% BSA/PBS 进行稀释。

5.       在室温下或 4 ℃ 的避光孵育至少 30 分钟。

6.       细胞洗涤 3 次:以 400 g 的速度离心 5 分钟,然后在冰冷的 PBS 中重悬。您可能需要根据所用的细胞类型调节离心条件(离心力和离心时间)。

7.       (依照制造商说明书)使用 3% BSA/PBS 将荧光染料标记二抗稀释到最佳浓度,然后在该溶液中对细胞进行重悬。

8.       在 4 ℃ 或室温下孵育至少 20-30 分钟。此孵育步骤必须在黑暗环境中进行。

9.       细胞洗涤 3 次:以 400 g 的速度离心 5 分钟,然后在 含 3% BSA、1% 叠氮化钠的冰冷 PBS 溶液中重悬。

10.   立即将细胞悬液转移至 4 ℃ 的黑暗环境中保存。

11.   分析:为了获得最佳结果,请尽快使用流式细胞仪对细胞进行分析。

我们建议您在当天进行分析。为了延长储存时间(16 小时),同时适应灵活安排使用细胞仪的时间,可使用 1% 多聚甲醛重悬细胞以防止变质。


固定:

如果分析之前的等待时间超过 1 小时,您可能需要在第 5 步后固定细胞。此操作可使细胞保留数天(可以使光散射稳定并使大部分有生物危害的试剂失活)。对照组需要通过相同的程序进行固定。如果细胞需要保持活力,则不应固定。固定细胞的方法有多种。操作人员需要对不同抗原的固定进行调整优化。

1.       每份样品中加入 100 µL 0.01% 至 1% 的多聚甲醛固定 10-15 分钟。

2.       丙酮或甲醇:

N/B 聚苯乙烯//塑料管不适用于丙酮

向每份样品中添加 1 mL 冰冷的丙酮。
轻轻混匀。在 -20 ℃ 下静置 5-10 分钟。
离心,然后用含 1% BSA 的 PBS 洗涤两次。



如果您希望恢复细胞功能,例如要收集细胞进行功能研究,请勿向缓冲液中添加叠氮化钠。这种试剂会抑制代谢活动。


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