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免疫沉淀(IP)实验方案

常规免疫沉淀 (IP) 步骤,包含试剂信息和帮助您正确选择蛋白质微珠的表格。

免疫沉淀是一种纯化蛋白质的方法。将目标蛋白的抗体与细胞提取物一起孵育,使抗体与溶液中的蛋白质结合。然后利用蛋白 A/G 偶联的琼脂糖微珠从溶液中分离出抗体/抗原复合物,从而将目标蛋白质从复杂样品中分离出来。最后通过 SDS-PAGE 即可分离出样品用于蛋白质印迹分析。

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目录



裂解缓冲液

理想的裂解缓冲液可最大程度减少蛋白质变性,同时能够从样品中释放出足量的蛋白质。相较于 SDS 和脱氧胆酸钠等离子去污剂,NP-40 和 Triton X-100 等非离子去污剂的性质更加温和。其他会影响免疫沉淀反应的变量包括盐浓度、二价阳离子浓度和 pH 值。要优化这些变量,需要在以下范围内对其进行测试(摘自 Harlow 和 Lane,第 231 页):

·         盐:0–1 M

·         非离子去污剂: 0.1–2%

·         离子去污剂: 0.01–0.5%

·         二价阳离子:0–10 mM

·         EDTA:0–5 mM

·         pH: 6–9


非变性裂解缓冲液

适用于可溶于去污剂、其抗体在天然形式识别的抗原。Triton X-100 可替代 NP-40。

·         20 mM Tris HCl pH 8

·         137 mM NaCl

·         1% Nonidet P-40 (NP-40)

·         2 mM EDTA

在 4°C 下至多可保存 6 个月。临用前加入蛋白酶抑制剂。

为方便起见,可制备 10% 脱氧胆酸钠母液(5 g 溶于 50 mL 溶液中)。必须避光。

不含去污剂的可溶性蛋白质裂解缓冲液

有些可溶性蛋白质可能不需要使用去污剂。使用此缓冲液通过机械方式实现细胞裂解,例如使用杜恩斯匀浆器进行匀浆。

PBS 含有:

·         5 mM EDTA

·         0.02% 叠氮化钠

在 4°C 下至多可保存 6 个月。临用前加入蛋白酶抑制剂。

用于非去污剂可溶性抗原的变性裂解缓冲液

只能识别变性蛋白质的抗体无法识别天然蛋白质的抗原表位。收获和裂解细胞时,在变性裂解缓冲液中加热细胞。该方法还可用于无法通过非离子洗涤剂从细胞中提取出的抗原。使用 DNase1 有助于提取出染色质中的蛋白质。

·         1% SDS

·         5 mM EDTA

室温下至多保存 1 周。

临用前加入

·         10 mM 二硫苏糖醇或 β-巯基乙醇

·         蛋白酶抑制剂 15 U/mL DNase1

洗涤缓冲液

·         10 mM Tris;调节 pH 至 7.4

·         1 mM EDTA

·         1 mM EGTA;pH 8.0

·         150 mM NaCl

·         1% Triton X-100

·         0.2 mM 原钒酸钠

·         蛋白酶抑制剂混合物


在 4°C 下至多可保存 6 个月。临用前加入蛋白酶抑制剂。



其它试剂


​蛋白酶抑制剂

细胞裂解后随即发生蛋白水解、去磷酸化和变性。将样品置于冰上会减缓上述进程,也可加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。如果不使用混合物,则 PMSF (50 μg/mL) 和抑肽酶 (1 μg/mL) 是免疫沉淀中常用的蛋白酶抑制剂。

其它试剂

·         无菌 PBS pH 7.4

·         无菌 PBS-BSA 1% w/v(已过滤)

·         TBST 缓冲液

·         用于蛋白质印迹分析的上样/样品缓冲液

·         用于免疫沉淀二抗的 VeriBlot,该试剂在蛋白质印迹分析过程中可优先检出非还原型、非变性一抗。

·         100 mM EDTA 母液,将 1.86 g EDTA 溶于 40 mL H2O 中制得。添加 NaOH 将 pH 调节为 7.4。最后,将总体积调节至 50 mL。



制备裂解物


细胞培养物的裂解物(非变性)

1.       将细胞培养皿置于冰上,并用预冷的 PBS 洗涤细胞。

2.       弃去 PBS,然后加入预冷的裂解缓冲液(对于 每107 个细胞/100 mm2 培养皿/150 cm2 培养瓶加入 1 mL;对每 5x106 个细胞/60 mm2 培养皿/75 cm2 培养瓶加入 0.5 mL)。

3.       使用冰冷的塑料细胞刮棒刮下培养皿上的贴壁细胞,然后将细胞悬液轻轻地转移至预冷的微量离心管中。

4.       在 4 ℃ 下以恒定速率混匀30 分钟。

5.       在 4 ℃ 下使用微量离心机进行离心。

您可能需要根据细胞类型调整离心力大小和离心时间。建议以 12000 rpm 离心 20 分钟,但是您需要根据具体实验进行优化(例如,白细胞只需轻微的离心)。

6.       从离心机中轻轻取出离心管,将其置于冰上。吸出上清液并将其注入置于冰上的洁净管中,然后弃去沉淀物。


细胞培养物的裂解物(变性)

1.       向 0.5–2 x 107 个细胞中加入 100 μL 变性裂解缓冲液。

2.       以最大速度强力涡旋 2–3 秒钟将其搅匀。将细胞悬液转移至微量离心管中。

由于 DNA 的释放,此时的溶液具有一定的粘性。

3.       将样品加热至 95 °C 并保持 5 分钟,使其变性。

4.       使用 0.9 mL 非变性裂解缓冲液对悬液进行稀释。轻轻混匀。

非变性裂解缓冲液中多余的 1% Triton X-100 使原变性缓冲液中的 SDS 发生猝灭。

5.       将针头接至 1 mL 注射器上,对裂解悬液抽吸 5–10 次,使 DNA 裂成碎片。

重复机械破碎操作,直到粘度降低至可控水平。如果 DNA 未完全消解和破碎,则会在离心之后干扰沉淀物和上清液的分离

6.       在冰上孵育 5 分钟。

7.       继续进行免疫沉淀

组织裂解物

1.       用干净的工具尽可能快速地切割组织。如有可能,最好在冰上进行此操作,以防止组织被蛋白酶降解。

2.       将组织置于圆底的微量离心管中,并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用,或放置在冰上直接进行匀浆。

3.       对于约 5 mg 的一片组织,需要向管中快速添加约 300 µL 裂解缓冲液,然后用电动匀浆器匀浆。

4.       另取 300 µL 裂解缓冲液清洗刀片,共清洗两次,然后在 4 ℃ 下以恒定速率搅拌 2 小时(例如使用置于冰箱中的回旋振荡器)。

裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。为避免蛋白质损失并最大程度减小上样到凝胶的样品体积,蛋白质提取物不能太稀。最小浓度为 0.1 mg/mL;最佳浓度为 1–5 mg/mL。

​如果需要变性的样品,请使用变性裂解缓冲液并执行上述变性实验方案中的第 2–5 步。

5.       使用微量离心机在 4 ℃ 下以 12000 rpm 离心 20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管,将其置于冰上,吸出上清液并将其注入置于冰上的洁净管中。弃去沉淀。



​​预清洗裂解物

预清洗裂解物有助于降低非特异性结合和背景。但是,如果最后是通过蛋白质印迹来检测蛋白质,则可能必要进行预清洗,除非杂蛋白质会干扰目标蛋白质的可视化。

1.       向 1 mL 裂解物中加入 50 μL 来自相同物种和同亚型的非目标抗体作为免疫沉淀抗体,或加入 50 μL 正常血清(通常首选兔的血清,参见 Harlow 和 Lane,第 243 页)。在冰上孵育 1 小时。

2.       向裂解物中加入 100 μL 微珠悬浮液。

3.       在 4 °C 下孵育 10–30 分钟,同时轻微搅拌。

4.       使用微量离心机在 4 ℃ 下以 14000 x g 离心 10 分钟。

5.       弃去微珠沉淀物,保存上清液进行免疫沉淀。

为提高产率,可使用裂解缓冲液洗涤微珠 1 或 2 次,并将上清液收集在一起。


必须要尽量去除正常血清,因为它们会与抗体竞争目标抗原。为检查血清残留,可对裂解缓冲液(而不是样品)进行测试,执行以上所有预清洗步骤。

对所得上清液的凝胶进行电泳并采用考马斯亮兰法进行染色,这时可显示血清 Ig 是否得到有效去除。如果未充分去除血清,则会显示重链和轻链(50 和 25 kDa)的条带,它们会减弱免疫沉淀反应。此时,需考虑在预清洗步骤中减少血清量或增加与样品孵育的微珠量。​



免疫沉淀反应

免疫沉淀蛋白质可采用几种不同方法。第一种方法(方法 A)是先将蛋白质样品与抗体混合,然后加入蛋白质 A/G 支持。此方法可获得高纯度蛋白质;但是,抗体也会与目标蛋白质共洗脱,有时候会阻碍蛋白质印迹检测。

第二种方法(方法 B)是将抗体与蛋白质 A/G 微珠结合,然后与抗原混合。此方法的产率比前者低,但可避免抗体共洗脱问题。

方法 A

抗体在溶液中的免疫沉淀反应:

1.       向置于冰上的微量离心管中加入 10–50 μg 细胞裂解物和推荐量的抗体(见下文)。在预试验中,不断增加抗体量,直到沉淀的蛋白质的量不再变化。

查看抗体数据表中推荐的抗体浓度。根据参考使用

1–5 μL 多克隆抗血清
1 μg 亲和纯化的多克隆抗体
0.2–1 μL 腹水液(单克隆抗体)
20–100 μL 培养物上清液(单克隆抗体)

2.       在 4 °C 下,将样品与抗体孵育 1–12 小时,最好伴有轻微搅拌或旋转。孵育时长取决于蛋白质的量和抗体的亲和性。

3.       与此同时,制备琼脂糖微珠。如果使用单克隆抗体,请选用蛋白质 G 偶联琼脂糖微珠。如果使用多克隆抗体,通常选择蛋白质 A 偶联琼脂糖微珠(参见下表“选择蛋白质微珠”)。如果微珠为粉末状,请使用 1 mL 0.1 M PBS 对 100 mg 微珠进行孵育,洗涤 1 小时使其膨胀,然后离心,弃去上清液。

​加入 1 mL PBS 0.1% BSA,使用 Eppendorf 转子混合 1 小时,然后用 PBS 清洗两次。弃去上清液,加入 400 μL 由蛋白酶抑制剂制得的缓冲液(可与裂解缓冲液相同)。悬浮液已可以使用。悬浮液可在 4 °C 下保存数日;要延长保存期,请使用含 0.02% 叠氮化物的 PBS 保存微珠(在使用当天反复清洗微珠,并使用新鲜的裂解缓冲液进行制备)。您也可以购买可立即使用的悬浮液形式的预膨胀微珠。

建议使用削去末端的移液器吸头,避免破坏微珠。

使用 IgM 抗体时,请勿使用蛋白质 A 或 蛋白质 G 偶联微珠。请使用抗 IgM 偶联蛋白质 A 或蛋白质 G 微珠。然后 IgM 会通过结合抗 IgM 抗体与微珠结合。

4.       将悬浮液混匀并向每份样品中加入 70–100 μL 微珠。样品必须始终置于冰上。由于微珠很容易粘附在吸头两侧,请尽量减少移液器的移动并使用顶端被削去 5 mm 的吸头。

5.       在 4 °C 下通过旋转搅拌方式孵育裂解物微珠混合物 4 小时(可通过预实验确定最佳孵育时间)。

6.       继续下面的洗涤步骤。



方法 B

抗体-琼脂糖偶联物的免疫沉淀反应:

1.       要制备蛋白质 A 或 G 琼脂糖/琼脂糖凝胶微珠,请按照方法 A 中的第 3 步进行。

2.       向微量离心管中加入约 70–100 µL 的蛋白质 A 或 G 或 L 琼脂糖偶联物的悬浮液。

3.       加入 10 µL 一抗。使用免疫沉淀抗体数据表中推荐的稀释度作为参考。

4.       在 4 °C 下使用合适的振荡器轻轻混匀抗体-微珠混合物,并孵育 1–4 小时。

5.       在 4 °C 下以 1000–3000 x g 离心 2 分钟,然后弃去上清液。

6.       在持续轻微搅拌下向混合物中加入 1 mL 裂解缓冲液,然后在 4 °C 下以 3000 x g 离心 2 分钟。重复此洗涤步骤两次。

7.       完成微珠和抗体混合物的洗涤之后,加入 10–50 μg 细胞裂解物。

8.       在 4 °C 下通过旋转搅拌方式孵育裂解物-微珠/抗体偶联物混合物,根据需要孵育 4 小时至过夜(可通过预备实验确定最佳孵育时间)。

9.       孵育结束时,继续进行以下洗涤步骤。



洗涤

1.       对离心管进行离心,分离出微珠上清液并将其弃去。现在,目标蛋白质已特异性地结合到包被微珠的抗体上。

2.       使用洗涤缓冲液或裂解缓冲液洗涤微珠三次,消除非特异性结合。每次洗涤时,将微珠与洗涤缓冲液轻轻混匀,在 4 °C 下离心,然后弃去上清液。

3.       小心地操作,尽可能多地去除微珠中的洗涤缓冲液。现在,可将复合物从微珠中洗脱。



洗脱

将蛋白质从微珠中洗脱出来的方法有三种。SDS 缓冲液的洗脱性最强,还可将非共价结合抗体和抗体片段连同目标蛋白质一起洗脱。另一方面,甘氨酸缓冲液可轻度洗脱蛋白质和少量抗体。

甘氨酸缓冲液洗脱

在此过程中,使用含 0.1–0.2 M 甘氨酸的缓冲液 (pH 2.0–3.0) 进行酸化使复合物从微珠中洗脱出来。pH 值较低的甘氨酸可减弱抗体和微珠之间的相互作用。此方法的优点在于去除甘氨酸缓冲液之后,微珠还可重复使用。但是,应立即使用 Tris (pH 8.0–8.5) 对洗脱样品进行中和。

1.       使用 3 x 50 µL 0.2 M 甘氨酸 pH 2.6 (1:1) 对微珠 (50 µL) 进行洗脱,具体步骤为:孵育样品 10 分钟,伴以频繁搅拌,然后轻度离心。

2.       合并洗脱物,然后加入同等体积的 Tris pH 8.0 对其进行中和。

如有必要,请重复上述步骤。

3.       使用 150 µL 裂解缓冲液(不含去污剂)洗涤微珠 2 次对其进行中和,然后合并洗脱物。

4.       利用蛋白质印迹方法运行样品,检查蛋白质的沉淀情况。
​​

SDS 缓冲液洗脱

通过加入含变性剂 SDS 的上样缓冲液中并加热或煮沸,将 Ag-Ab 复合物从微珠中洗脱出来。此方法的优点在于提取方法十分高效且所得样品的浓度更高。

1.       对 50 µL 微珠,加入50 µL 不含 DTT 的 2 x SDS 上样缓冲液, 50 °C 下加热 10 分钟进行洗脱。

2.       沉淀微珠,将上清液转移至新试管中并加入 100 mM 的 DTT(洗脱 1)。

3.       向沉淀微珠中加入 50 µL 含 DTT 的 2 x SDS 缓冲液(洗脱 2)。

4.       将洗脱样品煮沸 5 分钟,通过蛋白质印迹分析样品内容物。通常情况下,洗脱 1 和 2 中都含有目标蛋白,只是二者中的含量有所不同,且洗脱 2 中的 IgG 污染物比洗脱 1 中更多。

尿素缓冲液洗脱

由于样品可被蛋白水解酶消化,因此该方法对质谱测定具有一定优势。

1.       使用预尿素洗涤缓冲液(50 mM Tris pH 8.5,1 mM EGTA,75 mM KCl)洗涤微珠。去除所有残留上清液。

2.       加入 2–5 体积的尿素洗脱缓冲液(6–8 M 尿素,20 mM Tris pH 7.5 和 100 mM NaCl),在室温下旋转 30 分钟,伴以频繁搅拌,然后进行轻度离心。

3.       重复此操作至少两次,确保采集的所有复合物都从微珠中释放出来。沉淀微珠,将尿素转移至新试管中。

4.       利用蛋白质印迹方法运行样品,检查蛋白质的沉淀情况。



选择正确的微珠 – 总结表


关键词:
+++ = 强结合
++ = 中度结合
+ = 弱结合
- = 无结合

各生物体免疫球蛋白同型

蛋白质 A

蛋白质 G

人 IgG1

+++

+++

人 IgG2

+++

+++

人 IgG3

-

+++

人 IgG4

+++

+++

人 IgM

使用抗人 IgM


人 IgE

-

+

人 IgA

-

+

小鼠 IgG1

+

+++

小鼠 IgG2a

+++

+++

小鼠 IgG2b

++

++

小鼠 IgG3

+

+

小鼠 IgM

使用抗小鼠 IgM


大鼠 IgG

-

+

大鼠 IgG2a

-

+++

大鼠 IgG2b

-

++

大鼠 IgG2c

+

++

鸡的所有同型

-

-

牛的所有同型

++

+++

山羊的所有同型

-

++

豚鼠的所有同型

+++

++

仓鼠的所有同型

+

++

马的所有同型

+

+++

猪的所有同型

+

++

兔的所有同型

+++

++

绵羊的所有同型

-

+++



参考文献

​​

  • Bonifacino, Juan S. et al.Current Protocols in Immunology 8.3.1 -8.3.28, New York:John Wiley, 2001.
  •  Harlow, Ed, and David Lane.Using Antibodies.Cold Spring Harbor, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.




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