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IHC抗原修复实验方案

了解抗原修复的两种方法:热介导法(也称为热诱导表位修复或 HIER)和酶法。

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大部分福尔马林固定的组织在免疫组化染色前需要进行抗原修复步骤。固定过程中形成的亚甲基桥会将蛋白交联起来,掩盖掉抗原位点。抗原修复方法则会破坏这些亚甲基桥,暴露出抗原位点,使抗体能够与之结合。用于抗原修复的两种方法分别为热诱导表位修复法 (HIER) 和酶修复法。

酶修复有时会破坏切片形态,因此需要对浓度和处理时间进行测试。

热诱导表位修复通常用压力锅、微波炉或蒸煮锅完成。有些实验室使用设置为 60 ℃ 的水浴槽,将切片置于修复溶液中孵育过夜。在处理高温加热时会从载片脱落的组织切片时,这种方法非常有效;特别是骨、软骨和皮肤。

若抗体数据表上没有说明抗原修复方法,则每个抗原的最佳修复方法必须通过实验确定。这一点也适用于选择用于热介导修复的缓冲液。最常用的缓冲液是 10 mM 的 pH 6 柠檬酸钠、pH 9 的 Tris-EDTA 以及 pH 8 的 EDTA。我们建议测试多种方法以寻找染色效果最佳的方法。



​用于热诱导表位修复的缓冲溶液

以下是 HIER 最常用的三种溶液,在没有数据表信息时,最好通过实验来选择修复缓冲液。

柠檬酸钠缓冲液(10 mM 柠檬酸钠,0.05% Tween 20,pH 6.0)

·         (二水合)柠檬酸三钠 2.94 g

·         蒸馏水 1 L

·         混合溶解,用 1N HCl 调节 pH 至 6.0。

·         加入 0.5 mL Tween 20 并充分混合,可在室温下储存 3 个月或在

·         4 ℃ 下长期储存

1 mM EDTA,pH 8.0

·         EDTA 0.37 g

·         蒸馏水 1 L

·         用 NaOH 将 pH 调节至 8.0

·         室温下可储存 3 个月

Tris-EDTA 缓冲液(10 mM 三羟甲基氨基甲烷,1 mM EDTA 溶液,0.05% Tween 20,pH 9.0)

·         三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 1.21 g

·         EDTA 0.37 g

·         蒸馏水 1 L

·         混合溶解,调节 pH 至 9.0。

·         加入 0.5 mL Tween 20 并充分混合,可在室温下储存 3 个月或在 4 ℃ 下长期储存。



热诱导表位修复方法:压力锅

在此过程中,载片应置于金属架上。

材料和试剂

·         家用不锈钢压力锅

·         电热板

·         带载片架的容器,容积约为 400-500 mL

·         抗原修复缓冲液(Tris/EDTA pH 9.0、柠檬酸钠 pH 6.0 或其它)


方法

建议通过以下方法进行对照实验以优化修复时间:同一组织切片的载片在免疫组化染色前修复 1、2、3、4 和 5 分钟。

1.       向压力锅中加入合适的抗原修复缓冲液,将压力锅放在电热板上并开到最大功率。此时不要密闭压力锅盖,仅将其扣上即可。在等待压力锅沸腾时,可对切片进行脱蜡和复水处理。

2.       沸腾后,将载片从自来水转移到压力锅中。

小心溶液高温 — 请使用镊子。

3.       根据制造商的说明密闭压力锅盖。

4.       压力锅达到最大压力后,计时 3 分钟。

5.       3 分钟后,关闭电热板,将压力锅放入空水槽。

6.       打开泄压阀并用冷水冲淋压力锅,压力下降后,打开锅盖并用冷水冲淋压力锅内部 10 分钟。

这样可以充分冷却载片,以便进行后续处理,同时使暴露至高温后的抗原位点能够重新还原。

请小心处理热溶液。

7.       按免疫组化染色实验方案继续后续处理。



热诱导表位修复方法:微波炉

不建议使用家用微波炉,常见的热点和冷点问题会导致抗原修复不均匀。由于没有加压环境,此方法的抗原修复时间通常较长,极易导致切片脱片。因此科研用微波炉更加合适。大部分品牌有自带的加压容器,可将温度维持在 98 ℃,防止切片脱片。

使用此方法时,缓冲液可能会沸溢,大量修复缓冲液将会蒸发。请时刻关注载片容器中的缓冲液面,必要时补充缓冲液。请勿让载片变干。

在此过程中,载片应置于塑料架和容器中。标准的玻璃组织染色架和容器在加热时会出现裂缝。

​材料和试剂

·         科研或家用微波炉 (850 W)

·         可用于微波炉的带载片架的容器,容积约 400-500 mL,或科普林氏缸

·         抗原修复缓冲液(例如,Tris/EDTA pH 9.0、柠檬酸钠 pH 6.0 等)

方法

1.       将切片脱蜡并复水。

使用足量的抗原修复溶液覆盖载片且液面至少高出数厘米。

2.       向微波炉适用的容器中加入合适的抗原修复缓冲液。

使用非密封容器以保证溶液沸腾时可蒸发,时刻关注蒸发情况,并在过程中注意沸溢现象,不要让载片变干。

3.       将载片放入微波炉适用容器中,将容器放入微波炉。如果使用家用微波炉,则设置为最大功率直到溶液沸腾,然后保持沸腾 20 分钟。如果使用科研用微波炉将程序设置为在温度达到 98 ℃ 后保持 20 分钟进行抗原修复。

使用非密封容器以保证溶液沸腾时可蒸发,时刻关注蒸发情况,并在过程中注意沸溢现象,不要让载片变干。

4.       20 分钟后,取出容器并用冷自来水冲淋内部 10 分钟。小心溶液高温。

这样可以充分冷却载片,以便进行后续处理,同时使暴露至高温后的抗原位点能够重新还原。

5.       按免疫组化染色实验方案继续后续处理。



​热诱导表位修复方法:蒸煮锅

许多实验室使用蒸煮锅或电饭锅进行热介导抗原修复,其步骤与微波炉方法类似,需要将缓冲液温度维持在 100 ℃,但不会像微波炉方法一样产生剧烈沸腾。此方法可改为使用设置为 100 ℃ 的水浴槽替代蒸锅。

在此过程中,载片应置于塑料或金属架和容器中。标准的玻璃组织染色架和容器在加热时会出现裂缝。

材料和试剂

·         蒸煮锅

·         带载片架的容器,容积约为 400-500 mL(如果使用 Tissue-Tek 容器,则容积为 250 mL)

·         抗原修复缓冲液(例如,Tris/EDTA pH 9.0、柠檬酸钠 pH 6.0)

方法

1.       如上所述,对切片进行脱蜡并复水。

2.       根据制造商的说明安装蒸煮锅并预热。

使用非密封容器以保证溶液沸腾时可蒸发,时刻关注蒸发情况,并在过程中注意沸溢现象,不要让载片变干。

3.       在烧瓶中预热适当的抗原修复缓冲液至沸腾。

4.       将不带载片架的容器放入蒸煮锅。

5.       小心地向容器中加入热缓冲液,然后放入载片架。如果方便的话,可在将容器放入蒸锅前向容器中加入缓冲液。

6.       盖上蒸锅盖,缓冲液容器也应该有盖。载片架一开始会让抗原修复溶液的温度降低,但数分钟内即可回到 95-100 ℃。

7.       自此时起,将容器置于蒸锅中蒸 20 分钟。

8.       20 分钟后,取出容器并用冷自来水冲淋内部 10 分钟。小心溶液高温。

使用非密封容器以保证溶液沸腾时可蒸发,时刻关注蒸发情况,并在过程中注意沸溢现象,不要让载片变干。

9.       按免疫组化染色实验方案继续后续处理。



​酶法抗原修复

适用的酶会在抗体数据表上有所说明。如未说明,则胰蛋白酶可用于多种需要福尔马林/PFA 固定后修复的抗原。

至少有两种向组织添加酶溶液的方法:直接吸取溶液滴到载片的组织上,或者将组织切片架放入酶溶液容器。第一种方法使用的试剂较少,但因为每个载片需要单独处理,需要密切关注每个载片的孵育时间以确保所有载片接受相同的处理。因此,处理大量载片时,将其浸入酶溶液的容器中会更加简便。如果使用自动染色系统(例如 Ventana),请向制造商咨询适当的酶法修复实验方案。

移液法:材料和试剂

·         37 ℃ 孵育器

·         加湿室(孵育器自带或装有湿纸巾的容器)

·         两个带载片架的 TBS 载片架容器

·         酶法抗原修复溶液(若使用胰蛋白酶,则请见下文)

胰蛋白酶母液(0.5% 蒸馏水溶液)

·         胰蛋白酶 50 mg

·         蒸馏水 10 mL

·         混合溶解,储存于 -20 ℃

氯化钙母液 (1%)

·         氯化钙 0.1 g

·         蒸馏水 10 mL

·         充分混合并储存在 4 ℃ 条件下

胰蛋白酶工作液 (0.05%)

·         胰蛋白酶母液 (0.5%) 1 mL

·         1% 氯化钙母液 1 mL

·         蒸馏水 8 mL

·         用 1N NaOH 调节 pH 至 7.8。可在 4 ℃ 条件下储存一个月或在 -20 ℃ 下长期储存


移液法:方法

1.       制备胰蛋白酶溶液并预热到 37 ℃,小心吸走组织切片周围多余的水,并吸取酶溶液(一般 50–100 μL 即可)滴到切片上。用移液器吸头分散溶液盖住切片四周;小心不要破坏组织。

2.       将载片放入加湿的容器中,然后放入 37 ℃ 孵育器。请勿将载片直接放到孵育器架上,因为温度变化可能会影响染色程度。最好将盛放载片的容器置于孵育器中预热。

3.       10-20 分钟后(可适当优化调整),从孵育器中取出载片并转移到盛有自来水的容器中的架子上。用流动的自来水中冲洗 3 分钟。

4.       按免疫组化染色实验方案继续后续处理。

浸入法:材料和试剂

·         37 ℃ 水浴槽

·         载片架和载片架容器

·         酶法抗原修复溶液(若使用胰蛋白酶,请参阅酶法修复移液法)


浸入法:方法

请仔细阅读所选酶附带的制造商文献,因为某些酶需要特殊的缓冲液和辅因子来保持其活性。

1.       将水浴槽设置到所用酶的最适温度,向两个盛放载片架的容器中加入超纯水,将容器放入水浴槽中加热。

使用足量的水或缓冲液,盖住载片。

2.       如上所述,对切片进行脱蜡并复水。将载片放入其中一个水容器中加热。

将冷载片放入酶溶液中会降低溶液的温度,降低酶活性,导致抗原位点修复不完全。

3.       在另一个容器中用温水制备酶抗原修复缓冲液,然后将容器放回水浴槽,重新加热溶液。

制备酶抗原修复溶液时,操作要尽量快,以防止酶活性降低。在放入载片前,请等待溶液温度回升。

4.       将加热的载片放入酶溶液中 10-20 分钟并间断轻微搅动,然后取出载片并使用流动自来水冲洗 3 分钟以冲去酶。

在免疫组化染色前,应通过在酶溶液中孵育组织切片 10、15、20、25 和 30 分钟来测定最佳修复时间。

5.       按免疫组化染色实验方案继续后续处理。



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