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蛋白质印迹(Western blot)实验方案

蛋白质印迹流程

打印蛋白质印迹实验方案


溶液和试剂

裂解缓冲液

这些缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周,或者以分装形式在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。

Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液

150 mM NaCl
1.0% NP40(可用 0.1% Triton X-100 替代)
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂

RIPA 缓冲液(放射免疫沉淀试验缓冲液)

150 mM NaCl
1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100
0.5% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS(十二烷基硫酸钠)
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂

Tris-HCl 缓冲液

20 mM Tris-HCl pH 7.5
蛋白酶抑制剂

电泳、转膜、封闭缓冲液

Laemmli 2× 缓冲液/上样缓冲液

4% SDS
10% 2-巯基乙醇
20% 甘油
0.004% 溴酚蓝
0.125 M Tris-HCl

测定 pH 并调节至 pH 6.8。


电泳缓冲液(Tris-甘氨酸/SDS)

25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
0.1% SDS

测定 pH,pH 应为约 8.3。必要时进行调节。

转膜缓冲液(湿转)
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
20% 甲醇

测定 pH,pH 应为约 8.3。必要时进行调节。

对于大于 80 kDa 的蛋白质,我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。

转膜缓冲液(半干转)

48 mM Tris
39 mM 甘氨酸
20% 甲醇
0.04% SDS

封闭缓冲液
5% 奶粉或 BSA(牛血清白蛋白)
加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”,其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。

实验步骤

样品裂解

1. 制备细胞培养物裂解物

  1. 将细胞培养皿置于冰上,用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
  2. 吸出 PBS,然后加入冰冷的裂解缓冲液(每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 培养瓶加入 1 ml;每 5×106 细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 培养瓶加入 0.5 ml)。
  3. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞,然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。
  4. 在 4 ℃ 下持续搅拌 30 分钟。
  5. 在 4 ℃ 预冷的离心机中以 16,000 × g 的转速离心 20 分钟。
  6. 轻轻地从离心机中取出离心管,置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中,弃去沉淀。


2. 制备组织裂解物

  1. 用干净的工具切取目标组织,此操作最好在冰上进行,并且应尽快完成,以防止样品被蛋白酶降解。
  2. 将组织置于圆底微量离心管或 Eppendorf 管中,并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用,或放置在冰上直接进行匀浆。对于约 5 mg 的组织,向离心管中快速加入约 300 μL 裂解缓冲液,然后用电动匀浆器进行匀浆,用另外 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次,然后在 4 ℃ 下持续搅拌(例如,在回旋振荡器上)2 小时。
  3. 4 ℃ 下在微型离心机中以 16,000 × g 离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管,置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。


样品制备

  1. 取出小部分 (50 μL) 裂解物,用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
  2. 向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的 2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性,除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
  3. 还原和变性:在 100 ℃ 下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸 5 分钟,并进行分装。在 -20 °C 下保存裂解物。注意:分装细胞裂解物 (50 - 100 μL),避免反复冻融循环。
  4. 在 37 ℃ 下解冻装有细胞裂解物的离心管。在微型离心机中以 16,000 × g 离心 5 分钟。


上样和电泳

  1. 将等量的蛋白质和分子量标准上样到 SDS-PAGE 凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为 20 - 30 μg,纯化蛋白的上样量为 10 - 100 ng。
  2. 在 100 V 下电泳 1 至 2 小时。

可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶,除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。

凝胶百分比取决于蛋白质的大小:

4 - 40 kDa

20%

12 - 45 kDa

15%

10 - 70 kDa

12.5%

15 - 100 kDa

10%

25 - 200 kDa

8%

将蛋白质从凝胶转移到膜上

如下制备转移堆叠体:

膜可以是硝酸纤维素或 PVDF,两者各具优点。用甲醇“活化”PVDF 1 分钟,并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。

所得膜可用于抗体染色。


抗体染色

  1. 用 5% 封闭溶液在室温下封闭膜 1 小时,或在 4 ℃ 下封闭过夜。
  2. 用适当稀释度的一抗在 5% 或 2% 封闭溶液中 4 ℃ 过夜孵育膜,或在室温下孵育 2 小时。
  3. 用 TBST 洗涤膜 3 次,每次 5 分钟。
  4. 用推荐稀释度的标记二抗在含 5% 封闭缓冲液的 TBST 中室温孵育膜 1 小时。
  5.  用 TBST 洗涤膜 3 次,每次 5 分钟,然后用 TBS 冲洗。
  6. 要产生信号,请遵循试剂盒制造商的建议。
  7. 移除多余的试剂,并用透明塑料膜覆盖膜。
  8. 利用暗室显影技术采集化学发光图像,或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。

相关链接

查看所有 Abcam 上样对照

示例上样对照:ab8227 beta actin

所有泳道:beta Actin 抗体 - 上样对照 (ab8227),稀释度为 1/5000

泳道 1:HeLa 全细胞提取物
泳道 2:酵母细胞提取物
泳道 3:小鼠脑组织裂解物

查看可获得的阳性对照裂解物封闭肽和阳性对照蛋白列表。

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