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在本操作中,活性明胶酶消化包埋在聚丙烯酰胺凝胶中的明胶。考马斯染色后,降解区域显示为深染色背景上的亮条带。
本实验方案针对在条件培养基中检测所分泌的 MMP-9 和 MMP-2 活性进行了优化。
跑胶
分离胶(7.5% 丙烯酰胺) | 浓缩胶 | ||
1.5 M Tris pH 8.8 | 2 mL | 0.5 M Tris pH 6.8 | 1.25 mL |
30% 丙烯酰胺 | 2 mL | 30% 丙烯酰胺 | 0.67 mL |
H2O | 2 mL | H2O | 3.08 mL |
4 mg/mL 明胶 | 2 mL | 10% SDS | 50 μL |
10% SDS | 80 μL | 10% APS | 50 μL |
10% APS | 80 μL | TEMED | 10 μL |
TEMED | 10 μL | |
凝胶的洗涤与染色
5X 非还原样品缓冲液 (pH 6.8)
最终浓度 | 每 250 mL |
4% SDS | 10 g |
20% 甘油 | 50 mL of 100% |
0.01% 溴酚蓝 | 0.025 g |
125 mM Tris-HCl | 4.91 g |
H2O | 200 mL |
最终浓度 | 每 250 mL |
2.5% Triton X-100 | 6.25 mL of 100% |
50 mM Tris HCl | 12.5 mL of 1 M stock |
5 mM CaCl2 | 625 μL of 2 M stock |
1 μM ZnCl2 | 2.5 μL of 0.1 M stock |
H2O | 228 mL + 2 mL 2% NaN3 |
最终浓度 | 每 250 mL |
1% Triton X-100 | 2.5 mL of 100% |
50 mM Tris-HCl | 12.5 mL of 1 M |
5 mM CaCl2 | 625 μl of 2 M |
1 µM ZnCl2 | 2.5 μl of 0.1 M |
H2O | 233 mL + 2 mL 2% NaN3 |
每 100 mL | |
甲醇 | 40 mL |
醋酸 | 10 mL |
H2O | 50 mL |
考马斯亮蓝 | 0.5 g |
每 1 L | |
甲醇 | 400 mL |
醋酸 | 100 mL |
H2O | 500 mL |