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流式细胞术的荧光补偿。
本文介绍了流式细胞术需要补偿的原因,以及如何应用补偿。请参见制造商说明和软件手册,获取有关您仪器的详细补偿步骤。
所有的荧光染料都同时具有激发和发射光谱。激发光谱是增加荧光染料能量的光波长范围,可使荧光染料发射另一波长范围的光,即发射光谱。
在流式细胞仪中,带通滤光片用于选择适宜范围的激发和发射波长。但是,当发射光谱重叠时,会检测到来自一种以上荧光染料发射的荧光。因此,为修正这类光谱重叠,需要进行荧光补偿。这一过程可确保特定检测器检测的荧光仅来自目标荧光染料。
下面的示例中,受 488 nm 的光激发后,PE 发射的光大部分被专门检测 PE 的检测器检测到,但是发射光谱尾部落在了用于检测 PE-Cy5 的带通滤光片中。这样,PE-Cy5 通道中就会观察到“假阳性”信号,因此需要进行荧光补偿以修正这类重叠。
(PE-Cy5 + PE 重叠) - (PE 重叠) = 准确的 PE-Cy5 结果
为任何细胞仪设置正确荧光补偿的步骤本质上是一样的,但不同的仪器之间会有轻微差异,因此很难提供“万全”的实验方案。尽管如此,以下指导方法在多数情况下仍适用。我们通常建议查看流式细胞仪制造商说明,以获取详细的荧光补偿指南。
该文档是与英国癌症研究院 FACS 实验室(位于英国伦敦林肯因河广场 44 号)的 Derek Davies 共同制作完成。