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ELISA 样品制备指南

进行 ELISA 前制备样品的提示

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请参阅随试剂盒提供的实验方案,了解有关样品制备和相容性样品类型的产品特定详细信息。

该指南适用于制备 ELISA 测定法中用到的常规样本,而最优的样品制备程序可根据需测定靶标及测定方法法作相应调整。选用新测定方法时,建议查阅相关文献选择与您样本相似的实验步骤作为参考。

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样品制备方法

细胞培养物上清液​

  • 将培养基移至离心管, 4℃, 1,500 rpm 离心 10 分钟。
  • 立即进行上清液的分装(血清)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。

细胞提取物​

  • 将组织培养板放置在冰上
  • 吸出培养基并用预冷PBS 轻轻洗涤细胞一次
  • 吸出 PBS ,加入100 mm 培养板加入0.5ml完全提取缓冲液
  • 收集细胞至在倾斜板中,然后移至经过预冷的离心观众。
  • 短暂涡旋后在冰上孵育 15-30 分钟
  • 在 4℃ 下13,000 x rpm 离心 10 分钟,沉淀不溶性内容物
  • 将上清液(这里是指可溶性细胞提取物)分装至预冷的离心管中,并于 -80℃ 保存。尽可能减少反复冻融次数。

条件培养基​

  • 将细胞接种到完全(含血清)生长培养基中,使细胞增殖达到一定的融合率。
  • 弃去培养基,数毫升预热PBS 小心洗涤。重复洗涤步骤。
  • 弃去PBS 洗涤液并小心加入无血清培养基。
  • 孵育 1-2 天。
  • 将培养基移至离心管, 4℃ 1,500 rpm 离心 10 分钟。
  • 立即分装上清液(血清)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。

乳汁

  • 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。
  • 分装上清液并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。


血浆​

  • 将全血收集到含抗凝剂的管中,例如 BD 抗凝真空采血管(目录号:363080/363080)或添加 0.1M 柠檬酸钠至 1/10 终体积。
  • 4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。
  • 立即分装上清液(血浆)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。

尿液

  • 集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。
    等分上清液(血清)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数
    ​收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。
  • 等分上清液(血清)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数


唾液

  • 收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。  
  • 立即分装上清液(血浆)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。


血清

  • 将全血收集到未经处理的测试管中,或者到不含抗凝剂的管中,如 BD 血清用真空采血管(目录号:367812)。
  • 在室温下连续孵育 20 分钟。
  • 4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。
  • 立即分装上清液(血浆)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。


组织提取物

  • 用干净的工具解剖组织,最好在冰上、尽快进行,以防止被蛋白酶降解。
  • 将组织置于圆底的微量离心管中,并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80℃ 下以便后续使用或放置在冰上进行直接匀浆。
  • 对于约 5 mg 的组织片,可向管中添加约 300 µl 完全提取缓冲液(查看细胞/组织提取缓冲液配方),然后用电动匀浆器匀浆。
  • 清洗刀片两次,每次清洗使用 300µl 完全提取缓冲液,然后在 4℃ 下维持恒定搅拌 2 小时(例如置于冷室中的回旋振荡器上)。​​​
  • 4℃ 13,000 x rpm 离心 20 分钟。置于冰上,将上清液(这里是指可溶的蛋白质提取物)分装至新、预冷的管中并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。


裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。最终蛋白质提取物的浓度一般 > 1 mg/mL。  


细胞/组织提取缓冲液配方

  • 100 mM Tris, pH 7.4
  • 150 mM NaCl
  • 1 mM EGTA
  • 1 mM EDTA
  • 1% Triton X-100
  • 0.5% 脱氧胆酸钠

制备完全提取缓冲液所需的其它试剂:

  • 磷酸酶抑制剂混合物
  • 蛋白酶抑制剂混合物
  • PMSF


使用前,按照厂家描述加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物以及 PMSF 使终浓度为1mM。​



通用建议

  • 推荐的蛋白质提取物浓度为至少 1-2 mg/mL。
  • ​​通常,可用结合缓冲液将血清、血浆、细胞和组织提取物稀释50%。
  • 样品融化后,使用前,将样品在 4℃  10, 10,000 x rpm 离心 5 分钟以除去沉淀。


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