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BMDC 分离实验方案

本实验方案旨在指导您进行小鼠中分离未成熟的骨髓来源的树突状细胞 (BMDC)

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​​​实验步骤


分离


! 在 1-6 步中,确保所有的试剂和样品都置于冰上,因为这对细胞活性有着积极影响。

! 为保持无菌状态,采用无菌器皿在超净工作台内执行所有步骤。观看无菌技术视频指南。

1.于小鼠髋关节上方切下后腿,露出股骨和胫骨,膝关节和踝关节保持不动,用 KimwipesTM 擦拭以除去肌肉和组织。

! 股骨的骨髓比胫骨多。

! 仅使用完整的骨头,因为骨髓被破坏后无法保证无菌。

2.在培养皿中注入 70% 乙醇,将干净的骨头在其中浸泡 5-10 秒以完成外部消毒。清洗所有骨头,并将其放入周围加冰的无菌管中。

! 清洗骨头时,骨头可以在乙醇中放置更长时间,但要注意乙醇能渗入骨头并杀死活细胞。

3.在超净工作台内一律使用无菌器具,用剪刀在尽可能靠近关节处剪去骨头的两端。在注射器中注入预冷的 RPMI 完全培养基 (R10),然后将注射器针头插入骨头,将骨髓冲出至周围加冰的离心管中。冲洗 2-3 次,直至骨头完全变白。用移液管吸打骨髓液几次,以分离所有的团块。

4.R10 培养基中于 1500 rpm 转速下离心 5 分钟(1-2 次)。

5.R10 培养基中重新悬浮细胞沉淀,并用血细胞计数器和台盼蓝对活细胞进行计数。

! 使用血细胞计数器进行活细胞计数的过程可参见我们的详细实验方案。

6.用 10 mL 的 R10 + 20 ng/mL GM-CSF 稀释细胞,并以 2×106 活细胞/皿的密度接种到培养皿中。

7.将培养皿放入 5% CO2 的 37°C 培养箱中培养。

8.在第三天再加入 10 mL 的 R10 + 20 ng/mL GM-CSF

! 轻轻地添加培养基,以免干扰细胞生长。

9.在第六天移除一半的培养基 (10 mL)。

! 轻轻地移除培养基,以免干扰细胞生长。

10.简单地离心移除的培养基(因为 DC 为松散贴壁细胞,移除的培养基中可能含有),并将细胞沉淀重新悬浮于 10 mL 新鲜的 R10 + 20 ng/mL GM-CSF 中,然后添加回原来的培养皿中。

! 细胞可在第八天收获,如在第九天或第十天收获细胞,则重复第10步。

11.培养物上清液中的非贴壁细胞和松散贴壁细胞可用 PBS 轻轻冲洗收获,然后将其合并以进行后续实验。

! 大部分贴壁细胞为巨噬细胞,悬浮或松散贴壁细胞则是树突细胞 (DC) 和 F4/80+ 巨噬细胞。为获得高度纯化的组分,建议采取措施除去 F4/80+ 细胞并富集 CD11c+ 细胞群。

! 悬浮液中的大部分巨噬细胞均可同时表达 F4/80+ 和 CD11c。F4/80+ 细胞可以通过抗 F4/80 的磁珠阳性选择去除。完成该步骤后,CD11c+ DC 可通过加入抗 CD11c 的磁珠进行阳性选择获得。

! 此处避免使用 EDTA,因为 EDTA 可使贴壁的巨噬细胞悬浮,稀释 DC 样本。

12.未成熟的 DC 可以在纯化后立即使用,或者如果用户希望获得成熟的细胞也可以进一步培养。

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! DC 为松散贴壁细胞,仅附着于板即可成熟,因此可使用经非组织培养处理 的96 孔 U 型底微孔板以防止过早成熟。


纯度评估

建议取一份细胞进行流式细胞术实验以检查纯度。纯度检查试剂可用来标记仍附着于磁珠上的细胞。

推荐标记物

第三方检验

我们邀请了第三方合作者 Karen Wozniak 博士(德州大学圣安东尼奥分校研究助理教授)来运行我们的 BMDC 分离培养实验方案。采用实验方案中提到的 Abcam 试剂,Wozniak 博士能够成功纯化未成熟的 DC 细胞群。下面列出了相关数据。

纯度评估

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GM-CSF 培养和阳性筛选纯化后,用流式细胞仪检测细胞纯度。对 CD45+ 细胞设门后,根据细胞群表达 CD11c 的比例确定纯度(图 1)。

图 1. 利用磁珠去除 F4/80+ 细胞并阳性选择 CD11c+ 细胞后,使用抗-CD11c-生物素 (ab95765) 偶联链霉亲和素-FITC (ab136201) 检测纯度。与未纯化的样品相比,细胞纯度大大提高。


刺激

如果需要,纯化后的 DC 可以立即使用。然而,用户可能希望在加入 T 细胞前用抗原进一步培养 DC,以评估对相关抗原反应 T 细胞增殖。为促进 DC 将更多的抗原呈递给 T 细胞,也可选择性加入细胞因子,例如 IL-2 (ab9856)IL-4 (ab9729),IFN-γ (ab9922)​ 或 LPS。

为进行细胞刺激或处理,可根据下游应用的要求,将纯化的细胞接种到微孔板中。

  • 如果计划进行 ELISA,建议以每孔 2 x 105 个细胞的浓度接种到 24 孔板中。此外,DC 检测可在非组织培养处理的 96 孔 U 型底微孔板中进行,以提高通量。

用户可能希望使用流式细胞仪检测 DC 表型,特别是在进行 T 细胞检测时。


表型

我们的第三方合作者分别在纯化后(图 2)以及加入 20 ng/mL IL-4 (ab9729) 和 50 ng/mL LPS 并按每 100 µL 2 x 105 个细胞的浓度将纯化细胞培养 24 小时后使用流式细胞仪评估了小鼠 BMDC 的表型。

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图 2.纯化的小鼠 BMDC 细胞立即使用 CD11c-FITC (ab95765)CD80-APC (ab25555)CD86-PeCy7 (ab81995),及 MHC II-PE (ab93560)进行流式细胞仪分析。

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图 3.加入  IL-4 (ab9729)和 LPS 培养纯化的小鼠 BMDC 24 小时后,立即使用CD11c-FITC (ab95765)CD80-APC (ab25555)CD86-PeCy7 (ab81995)MHC II-PE (ab93560)通过流式细胞仪再次评估细胞纯度。


推荐标记物

可使用我们的免疫细胞表型分型标记物指南中介绍的常见 DC 标记物。


试剂和仪器


EDTA

乙醇 (70%)

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (ab9742)

热灭活胎牛血清 (HI-FBS)*

L-谷氨酰胺

青霉素

磷酸盐缓冲液 (PBS)

RPMI培养基

链霉素

β-巯基乙醇 (β-ME)(组织培养级)

台盼蓝

无菌 KimwipesTM

无菌器械(剪刀和镊子)

细菌培养皿 (100 mm x 15 mm)

注射器 (3 mL) 和针头(31½ 规格)

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*如果 FBS 未进行热灭活,可将其放置在 56oC 水浴中一小时进行灭活,然后冷却至室温

溶液

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实验开始前请准备以下溶液。

RPMI 完全培养基 (R10)

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将下列试剂加入 RPMI 培养基,然后用 0.22 µm 滤膜无菌过滤至无菌、无内毒素的瓶子中。



HI-FBS

10%

L-谷氨酰胺

2 mM

青霉素

100 U/mL

链霉素

100 µg/mL

β-ME

50 µM



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