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多色流式细胞术组合设计

一份帮助用户构建流式细胞术多色组合的快捷、简便指南

流式细胞术是一项同时鉴定和分析多种抗原的强大工具。但是,抗原和荧光染料数的增加会加大实验设计的复杂程度。在组合设计过程中,您可以遵循以下五个步骤来克服这些困难:

1.流式细胞仪简介

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在开始设计多色流式细胞术组合前,需要确定 (a) 激光的数量和类型、(b) 检测器的数量以及 (c) 适用于所用流式细胞仪的滤光片类型。根据这些条件确定要使用的荧光染料类型。
荧光染料的激发波长需要与可用的激光匹配。此外,荧光染料的激发波长还需与可用的滤光片匹配,并且要考虑滤光片可允许通过的波长。

您可以参考仪器手册或咨询平台实验室管理员,以确保获得最佳检测。

2.细胞群、抗原及荧光染料

某些细胞群很罕见,或由于功能差异以及受细胞活性水平的影响抗原浓度较低。一般而言,这种情况应使用最亮的荧光染料。例如,PE 通常用于抗原表达水平低或表达情况不明的靶标,以及/或罕见的细胞群。针对抗原表达水平高的靶标则应使用更暗的荧光染料,例如 PerCP。应该注意的是,荧光染料的亮度会受到多种因素的影响,例如所用缓冲液以及流式细胞仪类型。

荧光染料的相对亮度可参考我们的荧光染料表

3.光谱重叠

若需选择光谱重叠较少或没有光谱重叠的荧光染料,就不能选用最亮的荧光染料。但是,为避免荧光泄露,可以适当牺牲检测器中的亮度。通过保证最小程度的重叠,可以减少所需的荧光补偿

4.对照物

对照物包括未染色的细胞、活/死细胞标记物、单染阳性对照以及荧光扣除对照 (FMO),这些对于复杂的多色套装至关重要。有关详细信息,请参阅我们的推荐对照物指南

5.染色优化

抗体浓度:抗体浓度不佳会增加非特异性结合,或降低测定灵敏度。因此,所有抗体都应进行滴定,以确定最佳的信噪比。

Fc 阻断:吞噬细胞(例如单核细胞)的表面覆盖有 Fc 受体 (FcR’s),这些受体可以非特异性结合(而不是通过受体-配体相互作用)到抗体的 Fc 域。可以在染色前添加 FcR 阻断剂来阻断此类结合,例如,用于小鼠样品的 CD16+CD32 抗体 (ab25235) 和用于人类样品的人 IgG。应在制备组织匀浆样品期间添加阻断剂,因为样品中可能包含巨噬细胞,以及Daudi 和 THP-1 等细胞系。


完成上述五个步骤后,您就可以设计和运行复杂的多色流式细胞实验,并可避免很多常见问题。更多有关流式细胞术的信息,请访问我们的资源整合页面:

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