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抗体是生命科学和临床研究中最常用的工具之一,用于研究各种生物学通路和疾病中的蛋白质及其功能。
好的抗体具有靶标特异性和灵敏度,即使在低表达水平下也能识别目的蛋白。但是,越来越多的研究表明,并非所有抗体都具有靶标特异性,也有许多抗体表现出与脱靶蛋白的交叉反应性。从而导致实验不可重复性这一公认问题。1这些非特异性抗体会导致资源浪费,并妨碍科学进步。2,3
解决方案:敲除验证
接受度最广且最受信任的抗体特异性验证过程之一是基因敲除 (KO) 验证。4 KO 验证是一项非常稳健的技术,可在不表达目的蛋白的 KO 细胞系或组织中通过检测目的抗体来确证其特异性。
在 KO 细胞系中测试特异性抗体时,特异性抗体不会产生信号,但在野生型 (WT) 细胞系测试特异性抗体时,特异性抗体会产生特异性靶蛋白信号。以这种方式,KO 验证作为真正的阴性对照,以确认抗体对目标蛋白的特异性。4,5
Abcam 使用广泛的人 KO 单倍体细胞系库来进行抗体验证。这些 KO 细胞系通过 CRISPR-Cas9 生成,并通过 Sanger 测序鉴定。这种类型的 KO 细胞系提供了来自单个等位基因 KO 的完全丧失功能的表型,并消除了在二倍体细胞模型中观察到的来自第二个等位基因对敲除的任何掩盖。6-8
当 KO 验证我们的抗体时,我们主要使用 western blot 来评估结果。KO 验证可产生一系列 western blot 结果,以下示例给出了我们处理这些结果的方式。
特异性抗体
图1: Cdk4 RabMAb® 产品 (ab108357)。KO 样本中正确分子量 (MW) 的预期条带消失。
所有泳道:1/1000 稀释度的 Cdk4 兔单克隆抗体 [EPR4513] (ab108357)
泳道1: 野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2: Cdk4 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小: 34 kDa
观测条带大小: 34 kDa
内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗:
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
部分特异性抗体 - 额外条带
图2:Cdk6 小鼠单克隆产品 (ab54576)。KO 样本中正确MW 的预期条带消失;因此,抗体可识别其预期靶标。然而,在 WT 和 KO 样本中也存在额外条带。这可能是由于抗体与其他蛋白家族成员/亚型或不相关的蛋白质有交叉反应。
所有泳道:1/1000 稀释度的 Cdk6 抗体 (ab54576)
泳道1:野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2:Cdk6 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小:37 kDa
观测条带大小:37 kDa
内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8227)
二抗:
IR 染料 800 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗兔 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性抗体 – KO 样本中的弱信号
图3:Akt1 RabMAb® 产品 (ab32038)。KO 样本中存在正确 MW 的预期条带,但强度低于 WT 样本。然而,该抗体可能与样本中分子量与目标蛋白相同的其他蛋白家族成员/亚型有交叉反应。
所有泳道:1/1000 稀释度的 Akt1 兔单克隆抗体 (ab32038)
泳道1:野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2:Akt1 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小:55 kDa
观测条带大小:55 - 60 kDa
内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗:
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性抗体 – KO 样本中的信号
图4:Akt1 兔多克隆产品 (ab91505)。KO 样本中仍存在预期的 MW 带,强度与 WT 样本相同。使用基准抗体会在 WT 中显示目标条带,而在 KO 样本中无条带。
所有泳道:Akt1 兔多克隆抗体 (ab91505),1:1000
泳道1:野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2:Akt1 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小:55 kDa
观测条带大小:55 - 60 kDa
内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗:
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性抗体 - KO 和 WT 样本中均无目标条带
当看到 KO 验证标记时,您可以相信该抗体不仅在推荐的应用和种属中得到了验证,而且其特异性也已经通过我们内部 的KO 验证方法得到了确认。
我们应用 CRISPR-Cas9 技术开发了广泛的 KO 细胞系和裂解液,从而为您提供可靠的抗体,节省您的时间和金钱。每个 KO 细胞系都是单独克隆并通过 Sanger 测序验证的,同时内附亲代 WT 对照裂解液,用于在一致的细胞背景下评估基因敲除的生物学影响。