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成功完成免疫细胞化学/免疫荧光实验的技巧

确保 ICC/IF 实验最佳效果的技术提示和技巧

规划实验

根据具体实验需求和可用试剂,确定选择直接染色方法还是间接染色方法。两种方法都可进行多色染色,但各有利弊。

实验对照

对照极其重要,因为通常会将自发荧光以及一抗或二抗(用于间接检测)的非特异性结合误读为真实染色。

因此,确保使用正确的对照尤为重要,其中对照包括:

  • 未染色样品(未加一抗或二抗),用于了解自发荧光水平
  • 仅加入二抗的对照组,用于确定二抗与内源性细胞蛋白非特异性结合的可能性

制备细胞

确保细胞是健康的,因为培养条件的差异(例如,细胞密度)可能会影响细胞形态。最好使细胞在玻璃盖玻片上生长,固定当天的融汇度达到 50-60%。如果细胞过密或过稀,正常细胞结构可能会受到影响。此外,某些蛋白根据细胞融汇度而出现在不同位置。

固定/透化

细胞或组织的固定可能会掩盖抗体要结合的表位(对于单克隆抗体尤其如此)。为了明确您的样品是否需要固定,尝试向已固定或未固定的细胞中加入抗体。根据靶标/所用的抗体,所用的最佳固定剂有所不同。

对细胞内蛋白染色需要细胞透化,以使抗体接近细胞内组分。对每种抗体采用最佳透化步骤有所不同,因此应考察多种方法,例如尝试不同百分比的 Triton X-100 (0.1-0.25%)。

染色

在染色过程中,在任何时候切勿让细胞变干,因为细胞变干可能会引入伪影。这可以通过使用加湿器得以避免。

在加入荧光标记的二抗后,确保随后的所有孵育步骤避光进行,以避免荧光染料/蛋白淬灭。

在通过间接检测进行多色染色时,使用针对一抗和二抗的宿主物种进行预吸附的抗体,以减少物种间交叉反应和非特异性结合。

非特异性染色可通过以下方法减少:

  • 用来源于二抗的宿主物种的血清进行封闭
  • 使用少量抗体和/或缩短孵育时间
  • 在甲醛固定后用 0.1M 甘氨酸使残留乙醛淬灭。

共定位/复染

为了检测目标蛋白的分布或亚细胞定位变化,可使用特异于细胞器标记物的抗体来进行共定位/复染。常用的标记物包括 Tubulin(质膜)、TGN46(高尔基体)和 DRAQ5/7 (DNA/核)。

查看我们的细胞器标记物抗体

图像采集

免疫荧光图像通常仅包括少量细胞,因此确保图像具有群体典型性和代表性尤为重要。

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