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本页面是我们 IHC 应用指南的一部分:下载或在线阅读。
为了在 IHC 实验和储存过程中维持细胞和组织形态,组织样本的固定至关重要。固定组织样本还可以防止离体组织发生自溶和坏死,保留抗原性并提高组织成分的折射率。固定剂的使用受靶抗原以及所需检测技术(荧光 或 显色)的影响。然后将组织样本包埋在石蜡中或冷冻。包埋对保持组织形态并在切片过程中提供组织支撑很重要。一些表位在严格固定或包埋过程中可能会受到破坏。因此,通常将组织切成薄片(5-10 µm)或更小的片(用于全组织包埋研究),以便进一步研究。
石蜡包埋组织
生成石蜡包埋的组织样本时,必须先将组织固定,再包埋在石蜡中。切片后,立即通过灌注或浸入实现固定。该过程通常需要 4 到 24 小时(固定时间不建议超过 24 小时,因为这样可能导致过度固定,从而掩盖抗原)。
每种抗原的标准化固定剂对于可重现的染色都是必不可少的 - 固定不当的抗原可能检测不到。最合适 IHC 实验的固定剂取决于抗原,如下图所示。下表列出了一些固定剂类型使用准则。
固定剂对免疫染色模式的影响。
相较在甲醛中固定的细胞(左),在甲醇中固定的 HeLa 细胞(右)的免疫细胞化学中,更容易检测到组蛋白 H2B K5 的巴豆酰化。一抗:ab177139,组蛋白 H2B(巴豆酰基 K5)的兔多抗,1 μg/ml。二抗:ab150081, 山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor® 488), 0.5 μg/ml.细胞核用 DAPI 染色,微管蛋白(红色)用 ab7291和 ab150120染色。
固定剂选择准则
抗原 | 固定剂 |
大多数低分子量的蛋白质、肽和酶: | 细胞/细胞学样本制备:4% 甲醛 组织切片:10% 中性福尔马林(NBF)缓冲液; |
精细组织 | Bouin 固定液; |
氨基酸等小分子 | 4% 甲醛 |
造血器官(如肝、脾、骨髓) | Zenker 固定液 |
结缔组织 | Helly 固定液 |
核酸 | Carnoy 固定液 |
大分子蛋白抗原(如免疫球蛋白) | 冰浴丙酮或甲醇(100%) |
细胞核形态 | 福尔马林-硫酸锌溶液 |
电镜成像 | 4% 甲醛 - 1% 戊二醛 |
请注意,甲醛是一种气体,可在水溶液中保留其化学性质。福尔马林是 37-40% w/v 甲醛在水中的饱和溶液。因此,10% 的福尔马林约等于 4% 的甲醛。多聚甲醛是一种由大型甲醛聚合物组成的固体。福尔马林包含约 10% 的甲醇,由制造商添加,旨在减缓甲醛在溶液中聚合成多聚甲醛的速度。由于添加的甲醇可能会对某些样本的固定产生负面影响,因此一些方案建议在样本固定前用多聚甲醛制备福尔马林。
固定后,对组织作脱水处理,并用不溶于水的石蜡进行包埋。将组织浸入浓度逐步增加的脱水剂(如酒精)中,缓慢脱水。疏水性逐渐变化可以将细胞损伤降至最低。进行石蜡包埋前,在二甲苯中孵育组织,以便清除脱水剂。通常将石蜡加热至 60°C,使其硬化过夜。最后,使用薄片切片机将组织切片。组织切片可在显微镜载玻片上干燥,并在室温下长时间保存。然后,在开始免疫染色方案之前,将组织切片水化。
冷冻组织
冷冻组织可以通过将组织浸入液氮、异戊烷或将样本埋入干冰的方式制备。检测磷酸化等翻译后修饰时,常使用速冻方式。使用低温恒温器切割冷冻组织。得到的切片在 -80°C 下可保存长达 1 年时间。通常可以使用诸如甲醇或乙醇等醇类固定冷冻的组织切片。由于醇类不会掩盖抗原决定簇,因此使用醇类避免了抗原修复的需要。