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被掩盖的抗原表位可以使用酶/蛋白水解抗原修复 (proteolytic antigen retrieval, PIER) 或热诱导抗原修复方法 (heat-induced antigen retrieval method, HIER) 进行恢复。酶法中采用蛋白酶 K、胰蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶。热诱导抗原修复法采用热源(来自微波炉、高压锅、蒸锅、水浴锅或高压灭菌锅)和选定的缓冲液。最佳的抗原修复技术取决于抗原、组织、固定方法和/或一抗。有些抗原需要加热和酶解相结合才能修复。
为了确定适用于任何特定抗原的最佳修复方法,我们建议测试两种热诱导抗原修复法(例如用 pH 值为 6 的柠檬酸盐缓冲液和 pH 值为 9 的 Tris-EDTA 缓冲液)以及一种或两种酶抗原修复法(例如用蛋白酶 K 和/或胰蛋白酶)。对于固定程度较轻的冷冻切片,可能不需要进行抗原修复。
HIER | PIER | |
优势 | 表位修复更温和且可确定参数更多 | 可用于修复难以修复的表位 |
pH 值 | 通常使用 pH 值为 6 的柠檬酸盐缓冲液,但已证明 pH 值高的缓冲液也广泛适用于多种抗体。必须通过实验确定最佳 pH 值。 | pH 值通常为 7.4 |
温度 | 大约为 95°C | 通常为 37°C |
孵育时间 | 10-20 分钟(一般为 20 分钟) | 5-30 分钟(一般为 10-15 分钟) |
缓冲液成分 | 取决于所要求的 pH 值(pH 值取决于靶抗原,如下图所示)。常用的缓冲液包括柠檬酸钠、EDTA 和 Tris-EDTA | 含胃蛋白酶、蛋白酶 K 或胰蛋白酶等酶的中性缓冲溶液 |
注意事项 | 由于加热不均匀,使用微波加热会导致抗原表位修复不均衡。 煮沸也可以将组织从载玻片上剥离。 | 过度的酶修复有时会损害组织形态。 |
下图说明了优化抗原修复以改善染色的益处。
pH 对人体组织中热诱导抗原修复的影响参见 Emoto et al., (2005) Mechanisms of Heat-induced Antigen ReMeval: Does pH or Ionic Strength of the Solution Play a Role for Refolding Antigens? J Histochem Cytochem 53 (11):1311-21.
用于热诱导抗原修复的缓冲液
一步法抗原修复缓冲液含有洗涤剂以一步完成脱蜡和抗原修复,从而节省时间。
抗原修复缓冲液 | 一步法 | 100 X | 10 X |
柠檬酸盐缓冲液 pH 值为 6.0 | |||
EDTA 缓冲液 pH 值为 8.0 | |||
Tris 缓冲液 pH 值为 10.0 | |||
Tris-EDTA 缓冲液 pH 值为 9.0 |
我们还提供 10 x 通用 HIER 抗原修复试剂 ab208572 推荐与我们的 PDL-1 抗体克隆 28-8 一起使用。
用于酶抗原修复的缓冲液
缓冲液/酶制剂 | 产品 |
HistoReveal(新型快速温和的蛋白水解处理试剂) | |
胃蛋白酶 | |
蛋白酶 K | |
胰蛋白酶 |