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固定技术在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。固定方法的选择取决于表位和抗体本身的灵敏度,并且可能需要一些优化。
我们可使用交联剂(例如多聚甲醛)进行固定。交联剂更有利于保持细胞结构,但可能降低某些细胞组分的抗原性,因为交联会阻断抗体的结合能力。此时可能需要进行抗原修复,特别是固定时间较长或使用较高浓度的交联固定剂时。
福尔马林
如果在福尔马林中固定 10-15 分钟以上,则蛋白质的交联程度将升高并需要进行抗原修复,以确保抗体能自由接近蛋白质,达到结合和检测目的。
乙醇
甲醇
乙醇和甲醇会使细胞通透化。某些抗原表位对甲醇极为敏感,因为甲醇可能会破坏表位结构。如果出现这种情况,在需要通透化时,可尝试使用丙酮代替甲醇。
丙酮
丙酮也会使细胞通透化,因此不需要额外的通透化步骤。
浸泡固定
最常使用 10% 中性福尔马林缓冲液 (NBF)。如果数据表中说明了 IHC-P 是经测试的应用,那么除非另有说明,否则均使用此固定剂。其它固定剂的使用频率较少,例如 Bouin 溶液(多聚甲醛/苦味酸)。
理想的固定时间取决于组织块大小和组织类型,但 18-24 小时的固定时间适用于大部分应用。固定不足可能导致边缘染色,即切片边缘具有强信号而中间没有信号。固定过度可能会掩盖表位;抗原恢复可帮助克服此问题,但如果组织的固定时间过长(即超过两天),那么即使进行抗原恢复也可能没有信号。
灌注固定
对于小组织来说,浸入固定溶液通常能获得足够的固定。但是,如果将固定溶液经由内循环系统(无论是通过心脏或通过腹主动脉)灌注,则往往能获得更快速、更均匀的固定。下文介绍了使用 4% 多聚甲醛固定大鼠的大部分器官的实验步骤。
灌注固定中使用的试剂和器具
通过心脏灌注固定
通过腹主动脉灌注固定
灌注固定疑难解答
溶液从动物的窍孔中流出 - 针头未正确插入。
尝试将针头向上插入左心房,使溶液不会流入肺中。注意,不要将针头插入过深,以免穿透内壁。可能需要多练习才能插入正确的位置,因此您可以尝试轻微移动针头,直到溶液不再从动物的鼻腔或口腔流出。
固定时间太长 - 固定溶液未正确循环。
确保您已将针正确夹在插入点,针孔处没有泄漏,针也没有刺穿心脏。要确认这一点很容易,您可以擦干心脏周围区域,观察固定剂是否泄漏。您也可以尝试重置针头。
刺穿心脏 - 灌注固定可能不彻底,并且样品器官/组织可能未正确固定。
尝试用夹钳将穿刺伤口封闭。继续灌注,并且在切下器官后,确保将器官置于相同的固定液中 2 小时以上。这种情况下,最好在 4 ℃ 浸泡过夜。
如果样品器官是睾丸,在切下后,尝试向尖区(白膜层正下方)内注射一些固定剂,以便固定内部的输精管。如果注射正确,睾丸将轻微膨胀并变硬。
如果您能够定位样品器官中的静脉,则可尝试向静脉中手动注射(使用注射器)固定剂。
1. 将切片置于包被了 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APES) 的载片上并封片,然后在气流下风干 30-60 分钟,以尽可能完全干燥切片。
2. 将切片保存在 -80 ℃ 下待用。如需获得最佳结果,请立即使用。
3. 如有必要,将切片在室温下静置复温 5 分钟。
4. 在室温下制备固定剂(丙酮、甲醇或乙醇)。对于新抗体,我们建议使用 3 种载片进行预实验:
1) 多聚甲醛
2) 丙酮
3) 1:1 的丙酮:醇(甲醇或乙醇)溶液
5. 用固定剂在室温下固定 15 分钟。
6. 用 PBS 冲洗 3-4 次。
7. 如果用丙酮固定,则需在气流下风干 30 分钟,以达到完全干燥。
8. 按免疫组化染色实验方案继续后续处理。
如果用于免疫荧光实验的组织样本需要使用醛固定剂(多聚甲醛、戊二醛等)固定,则需在封闭液中加入 0.3 M 甘氨酸,然后加入一抗。
甘氨酸能够结合游离醛基,避免醛基结合一抗和二抗,使背景偏高。当选用戊二醛或多聚甲醛作为固定剂时,易出现游离醛基导致的高背景。