使用荧光底物的直接 ELISA 实验方案

使用荧光偶联一抗的直接 ELISA 测定的程序和提示

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一般程序:

第 1 天:

  1. 在滤过的 PBS 中稀释包被抗体后,在每孔中加入 100 μl 进行包被。用封板膜覆盖酶标板,将酶标板在 4℃ 下孵育过夜。

第 2 天:

  1. 将 4 g Block ACE 粉末稀释于 100 ml 去离子水中,使用其 1:4 稀释液在每孔中加入 200 μl,在室温下封闭酶标板 3 小时,封闭期间用封板膜覆盖酶标板。
  2. 洗涤酶标板:PBS-T (0.05% Tween20) 250 μl/孔;3x 30 s。

    Top tip Molly

    在洗涤或抽吸后,将酶标板翻转置于工作台的无尘纸上以除去多余的液体。

  3. 取 100 μl 刚刚在 10% BlockACE 的 PBS-T 溶液中稀释的标准品或样品,上样到酶标板,并在 4℃ 下孵育过夜,孵育期间用封板膜覆盖酶标板。

    Top tip Molly

    提前制备标准品。
    在将标准品上样到酶标板的当天(第二天),现将标准品在例如 10% BSA 的 PBS-T 溶液中稀释,稀释至 10 ng/ml 至 500 pg/ml

第 3 天:

  1. 以 100 μl/孔的量添加稀释于 PBS 中的生物素化报告抗体,在室温下孵育 2 小时,孵育期间用封板膜覆盖酶标板。
  2. 以 100 μl/孔的量添加以 1:5000 稀释于 PBS 中的链霉亲和素碱性磷酸酶,在室温下孵育 1 小时,孵育期间用封板膜覆盖酶标板。
  3. 洗涤酶标板:TBS 250 μl/孔;3x 30 s。
  4. 以 100 μl/孔的量添加 AttoPhos 荧光底物系统,在室温下孵育 5-10 分钟,使信号放大。使用前应将 36 mg AttoPhos 底物与 60 ml AttoPhos 缓冲液混合 24 小时。确保孔干净无污染。
  5. 在荧光计(Perkin Elmer 生产的 Victor2)上测定信号;激发波长:440 nm;发射波长:550 nm
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