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需要偶联二抗的 ELISA 实验的一般步骤和提示。
要得到准确的定量结果,通常做法是比较未知样品与标准曲线。每个酶标板都必须测定标准品(两重测定或三重测定)和空白样,以确保准确性。
将抗原包被到微孔板
封闭
一抗和二抗孵育
检测
虽然已使用许多不同类型的酶来检测,但是辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 测定中广泛使用的两种酶。某些生物材料具有高水平内源酶活性(例如肺泡细胞中的高水平 ALP、红细胞中的高水平过氧化物酶),考虑到这一事实是非常重要的,因为这可能会导致非特异性信号。如有必要,用左旋咪唑(针对 ALP)或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液(针对过氧化物酶)进行另外的阻断处理。
ALP 底物
pNPP(对硝基苯磷酸盐)是大多数应用最常用的底物。室温孵育 15-30 分钟后,可在 405 nm 处测定硝基苯酚呈现的黄色。(该反应可通过添加等体积的 0.75 M NaOH 终止)。
HRP 显色液
HRP 的底物为过氧化氢。过氧化氢的裂解与氢供体的氧化偶联,反应期间氢供体的氧化使颜色发生变化。
TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺)
将 TMB 溶液添加到每个孔,孵育 15-30 分钟,添加等体积的终止液 (2 M H2SO4),然后在 450 nm 处读取光密度。
OPD (o-邻苯二胺二盐酸盐)
在 492 nm 下测定终产物。注意:底物对光敏感,应存放在暗处。
ABTS (2,2’-联氮-双-[3-乙基]-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
终产物为绿色,可在 416 nm 处测定 O.D 值。
某些酶底物被认为是有害的(潜在致癌物),因此始终要小心处理并佩戴手套。
根据系列稀释液得到的数据绘制标准曲线,浓度标在 X 轴(对数标度)上,而吸光度标在 Y 轴(线性标度)上。通过标准曲线来计算出样品的浓度。
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