使用一抗的直接 ELISA 实验方案

直接 ELISA 的一般程序和提示

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缓冲液和试剂:

碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM)
应将抗原或抗体在包被缓冲液中稀释,从而将它们固定到孔上:
3.03 g Na2CO3
6.0 g NaHCO3
1000 ml 蒸馏水
pH 9.6

PBS:
1.16 g Na2HPO4
0.1 g KCl
0.1 g K3PO4
4.0 g NaCl (500 ml 蒸馏水) pH 7.4

封闭液:
常用的封闭剂为溶于 PBS 的 1% BSA、血清、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶。

洗涤液:
通常为 PBS 或含洗涤剂例如 0.05% (v/v) Tween20 的 Tris 缓冲生理盐水 (pH 7.4) (TBST)。

抗体稀释缓冲液:
应在 1x 封闭液中稀释一抗和二抗,以降低非特异性结合。


一般程序:

将抗原包被到微孔板

  1. 将抗原在 PBS 或其它碳酸盐缓冲液中稀释至 20 μg/ml 的最终浓度。移取 50 μl 抗原稀释液到 PVC 微量滴定板的第一排微孔中,使该微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要在微量滴定板上进行梯度稀释。

    Top tip Molly

    通常将含纯抗原的试样以低于 2 μg/ml 的浓度加到微量滴定板上。纯溶液不是必需的,但是原则上,试样中超过 3% 的蛋白质应为靶蛋白(抗原)。抗原蛋白质浓度不应超过 20 μg/ml,因为这将使微量滴定板上的大部分可用位点饱和。

    Top tip Molly

    确保样品所含抗原的浓度在抗体检测范围内。

  2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时,或在 4℃ 下孵育过夜。包被孵育时间可能需要某些优化。
  3. 弃去包被液,并洗涤微量滴定板两次,每次在微孔中加入 200 μl PBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板,除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板,除去剩余的液滴。

封闭

  1. 每孔添加 200μl 封闭缓冲液(5% 脱脂奶粉/PBS),封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。替代封闭剂包括 BlockACE 或 BSA。
  2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 2 小时,或如更方便的话,则在 4℃ 下孵育过夜。
  3. 用 PBS 洗涤微量滴定板两次。

用抗体孵育

  1. 添加 100 μl 抗体,其刚在使用前在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度(依照制造商说明书)。
  2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。此孵育时间可能需要优化。2 小时通常足以获得强信号,但如若获得弱信号,则当在 4℃ 下孵育过夜时往往会观察到更强的染色。
  3. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。

检测

  1. 使用多道移液器或多档移液器为每孔分配 100 μl(或 50 μl)底物溶液。
  2. 待显色充分后(如有必要),将 100 μl 终止液添加到微孔。
  3. 用酶标仪读取每孔的吸光度(光密度)。
    注意:某些酶底物被认为是有害的(潜在致癌物),因此始终要小心处理并佩戴手套。

数据分析:

由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线,浓度标在 X 轴(对数标度)上,而吸光度标在 Y 轴(线性标度)上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。

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