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N6-甲基腺苷(m6A)是 mRNA 和非编码 RNA 中的一种常见 RNA 修饰,可以影响 RNA 剪接、翻译、稳定性以及某些非编码 RNA 的表观遗传影响1。
测序技术近年来的发展衍生了高灵敏度技术,可用于在各种模型系统和细胞类型的转录组中定位 m6A。通过对 m6A 转录组范围内定位的了解,发现这项技术有着多项功能。显然,还有很多内容有待研究发现,尽管如此,我们现在对这种表观遗传标志物的生物学和调控作用已有了更深刻的理解。测序方法和技术的共同发展也让我们能够确定负责 m6A 功能、甲基化和去甲基化的 reader(m6A 结合蛋白)、writer(甲基转移酶)和 eraser(脱甲基酶)。
在此,我们介绍了必要 m6A writer、eraser 和部分重要 m6A reader 及其表观遗传学功能。
m6A 在细胞核内的动态调节由在 mRNA 上存储 m6A 的甲基转移酶 writer 复合物和去除相关标志物的 m6A 脱甲基酶进行。
已知 writer 复合物含有甲基转移酶 METTL32,3 和 METTL14、METTL3 接头 WTAP4 以及其他相关蛋白,包括 KIAA14295、RBM15/15B6 和 ZC3H137。在 METTL3-METTL14 甲基转移酶结构域复合物中,METTL3 充当催化亚基,而 METTL14 则提供 RNA 结合支架,激活并增强 METTL3 的催化活性7。WTAP 没有催化活性,但能与 METTL3 和 METTL14 相互作用,从而调节 RNA 转录的 m6A 水平7。
METTL3 和 METTL14 在胚胎发育和神经发生等不同生物过程中发挥着重要作用。经证实,METTL3 还能调控细胞重编程、精子发生、T 细胞稳态及内皮-造血转化。据报道,METTL14 是胶质母细胞瘤种的肿瘤抑制基因,在急性髓样白血病的发展和维持方面起到致癌作用。
已知有两种不同的酶参与 m6A 消除过程:FTO 和 ALKBH58,9。但是研究发现,FTO 优先对 m6A 脱甲基,m6Am 是一种与 m6A 相关的高丰度核苷,存在于 mRNA 中10。该项发现表明,ALKBH5 可能是主要的 m6A 脱甲基酶。
将 m6A 添加到 mRNA,随后进行消除的想法将是未来 m6A 研究的重要考虑因素。转录组中 m6A 水平的动态变化可能表明该表观遗传学标志物具备新功能。
图 1. m6A writer 和 eraser。点击图片下载交互通路。
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靶点名称 | 功能 | 位点 | abID 推荐 | 应用 | 种属 |
METTL3 | 在 RNA 上安装 m6A(催化亚基) | 细胞核 | Flow Cy、WB、IHC-P、ICC/IF、IP | 小鼠、大鼠、人 | |
WTAP | 将 METTL3 和 METTL4 定位到核小点上 | 细胞核 | ICC/IF、IP、Flow Cyt、IHC-P、WB | 人 | |
ALKBH5 | 脱甲基 m6A | 细胞核 | WB、IHC-P | 小鼠、大鼠、人 | |
FTO | 脱甲基 m6Am | 细胞核 | WB、IHC-P、ICC/IF | 人 |
m6A 招募名为 reader 的 m6A 结合蛋白,从而对 RNA 发挥作用。对 m6A reader 及其功能的了解正在迅速加深。越来越多的研究显示,新 m6A reader 对不同细胞类型和模型系统中的 m6A 发挥不同功能。
m6A 结合蛋白通常包含 YTH(YT521-B 同源)结构域。RNA 下拉显示,含有 YTH 结构域的蛋白通常是 m6A 结合剂11。这些不同的 YTH 结构域蛋白作用范围广泛,具体作用与其 m6A 结合能力相关。已知 YTHDF1 和 YTHDF3 协同作用可以提高目标 RNA 的翻译效率7,12。YTHDF2 在 mRNA 稳定性方面发挥着一定的作用13。YTHDC1 在 m6A 介导的选择性剪接方面具有重要意义14。研究表明,YTHDC2 能提高靶点翻译效率,但会降低靶点丰度15。
并非所有的 m6A reader 都包含 YTH;它们还包括真核起始因子 3(eIF3)、核不均一核糖核蛋白(HNRNP)和胰岛素样生长因子 2 mRNA 结合蛋白(IGF2BP)。eIF3 在翻译上游发挥作用,并且已经证实,该蛋白在 5'UTR 中会优先与 mRNA 的 m6A 结合,从而增强翻译作用16。两种 HNRNP 蛋白 HNRNPC 和 HNRNPG 能调控含 m6A 的 RNA 转录本的处理,作为结构开关藏匿 m6A,使这些转录本更容易结合7。据报道,IGF2BP 采用一种 m6A 依赖性方式来提高目标 mRNA 的稳定性和贮存17。
除参与 RNA 新陈代谢外,m6A reader 还参与不同的生物过程,包括肿瘤发生、血细胞生成、病毒复制、免疫应答和脂肪生成18。
图 2.m6A reader 及其功能。点击图片下载交互通路。
为了帮助您研究 m6A 功能,我们汇编了一份热销 m6A reader 重组单克隆抗体清单。
靶点名称 | 功能1,7 | 位点 | abID 推荐 | 经测试应用 | 种属 |
YTHDF1 | 调控 mRNA 稳定性和翻译 | 细胞质 | WB、IHC-P、Flow Cyt | 小鼠、大鼠 | |
YTHDF2 | 调控 mRNA 稳定性 | 细胞质 | WB、IP | 小鼠、大鼠、人 | |
Flow Cyt、WB、IHC-P、IP、ICC | 小鼠、大鼠、人 | ||||
YTHDF3 | 调控 mRNA 稳定性和翻译 | 细胞质 | Flow Cyt、IP、WB、IHC-Fr、IHC-P | 小鼠、大鼠、人 | |
YTHDC1 | 选择性剪接、lncRNA 介导的基因沉默 | 细胞核 | WB、IHC-P | 小鼠、大鼠、人 | |
YTHDC2 | 翻译 | 细胞质 | IHC-P、Flow Cyt、IP、WB | 小鼠、大鼠、人 | |
HNRNPC | 剪接调控、结构转换 | 细胞核 | WB、IHC-P、ICC/IF | 小鼠、大鼠、人 | |
HNRNPG | 细胞核 | WB、IHC-P、ICC/IF | 小鼠、大鼠、人 | ||
IGF2BP1 | 调控 mRNA 稳定性和贮存 | 细胞质 | WB、IHC-P、IP | 人 | |
IGF2BP2 | 细胞质 | WB、IHC-P、ICC/IF | 小鼠、大鼠、人 | ||
IGF2BP3 | 细胞质 | WB, ICC/IF, IP, Flow Cyt | 小鼠、大鼠、人 | ||
WB、IHC-P | 人 |
已经开发出在整个转录组中有效定位 m6A 的多种方法。最初的研究使用免疫沉淀法,该类方法利用特异性高的 m6A 抗体进行新一代测序19。这些方法被称为 MeRIP-seq。MeRIP 已经得到改进,现可用于单核苷酸分辨率 m6A 定位。这一操作可以通过极小的 RNA 片段(100-200 nt)结合免疫沉淀反应来实现。改进后的方法被称为 miCLIP(单个 m6A-核苷酸-拆分-交联和免疫沉淀),由 Linder 等人于 2015 年使用 Abcam m6A 抗体 ab15123020 首次提出。miCLIP 现已应用于多种不同细胞类型和生物的 m6A 定位,揭示了 m6A 的潜在新功能。
如果您想了解有关 RNA 修饰研究关键技术的更多信息,请查看我们的 RNA 修饰指南。如果您对 miCLIP 法感兴趣, 请查看我们的 miCLIP 方案。