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我们在此探讨 p53 的功能、结构和修饰,并概述可加速 p53 研究的工具。
目录
p53 是一种肿瘤抑制蛋白和转录因子,可调控细胞分裂,阻止 DNA 突变或受损的细胞进行分裂并通过转录调控向这些细胞传导凋亡信号,从而阻止肿瘤形成。
它可以对细胞应激或 DNA 损伤作出响应,激活多种转录靶标。p53 可协调多种反应,包括细胞周期阻滞、DNA 修复、代谢改变、抗氧化作用、抗血管生成作用、自噬、衰老和凋亡 (Bieging et al., 2014)。
细胞周期阻滞
p53 可以通过多种方式抑制细胞周期进程。其中之一是上调 p21 表达。随后,p21 蛋白结合细胞周期蛋白 E/Cdk2 和 D/Cdk4,导致细胞周期 G1 期阻滞 (Wade-Harper et al., 1993)。p53 还可以与其他 p53 靶基因结合,如 14-3-3σ(Martín-Caballero et al., 2001) 和 cdc25C (Clair et al., 2004),将细胞周期阻滞在 G2/M 期。
DNA 修复
p53 可阻滞细胞周期,支持修复机制的运作,并直接激活修复机制,进而在 DNA 修复中发挥一定的作用 (Williams et al., 2016)。p53 通常被称为“基因组卫士”,因为它会不断检查基因组中的 DNA 损伤迹象,例如双链断裂。p53 在多种不同类型的 DNA 修复中也发挥着积极的作用,包括核苷酸切除修复、碱基切除修复、错配修复和非同源末端连接 (Williams et al.,2016)。
p53 基因突变与癌症
TP53(编码 p53 的基因)突变是癌症中最常见的基因突变,在超过 50% 的肿瘤中丧失部分或全部功能 (Perri et al.,2016)。p53 突变为肿瘤细胞提供了选择性优势,使其能够避开细胞周期检查点,避免凋亡和衰老,并在正常细胞无法增值的条件下增殖 (Pascual et al., 2019)。
p53 蛋白是由 393 个氨基酸组成的四链四聚体,具有生物活性。每条链都有多个域。N 端有两个不同的反式激活结构域(TADI 和 TADII)、一个核输出信号(NES),后接富含脯氨酸的结构域(PD)和 DNA 结合结构域(DBD)(Wang et al., 1994)。
TADI(残基 1–42)和 TADII(残基 43–62)对 p53 的调控至关重要,因为它们为转录机制和负调控因子 MDM2 提供了结合位点。DBD(残基 102-292)对 p53 的转录活性至关重要。它包含 p53 共计 5 个保守区域中的 4 个。OD(残基 323–356)促使 p53 形成四聚体,后者形成两个二聚体中的一个二聚体 (Khoury et al., 2011)。
C 端有一个寡聚域(OD)、三个核定位信号(NLS)、一个 NES 和一个富含赖氨酸的调节域(RD)。三个 NLS 簇与特定受体结合,介导蛋白的核定位,促使 p53 选择性地通过核孔复合体。
C 端 NES 是一个高度保守的区域,有证据表明其对 p53 的核输出至关重要。p53 通过核质穿梭调节其转录功能需要 NLS 和 NES 区域 (Inoue et al., 2002)。
MDM2是负责野生型细胞中 p53 降解的 E3 泛素连接酶。p53 可以诱导 MDM2 的表达,从而创建 p53/MDM2 反馈环。约 17% 的肿瘤表现出 mdm2 基因扩增,导致 p53 水平降低,因此患者的预后差。因此,MDM2-p53 相互作用成为癌症治疗的关键靶标 (Nag et al., 2013)。
MDM2 研究工具:
MDM2 | |
抗体 | |
细胞面临压力时,p53 泛素化受到抑制,p53 在细胞核中积累,并通过翻译后修饰(包括磷酸化和乙酰化)活化并保持稳定 (Dai et al., 2010)。
这里我们重点介绍这些翻译后修饰(磷酸化和乙酰化)及其在 p53 应激反应中的作用。
p53 磷酸化
为响应细胞应激,p53 会迅速磷酸化。p53 含有多个丝氨酸和苏氨酸残基,可作为蛋白激酶的磷酸化位点 (Dai et al., 2010)。其蛋白激酶包括 ATM/ATR、Chk1/Chk2、CK1、CK2、PKC、CDK1/2、DNA-PK、HIPK2、ERK2、p38 和 JNK。
p53 磷酸化研究工具:
氨基酸 | 推荐抗体 | 应用 |
S15 | IHC-Fr、ICC/IF、IHC-P、WB、IP | |
S20 | WB、IP、Dot blot | |
S33 | Dot blot、WB、ICC/IF | |
S37 | Dot Blot、WB | |
S46 | WB、IP、IHC-P、ICC/IF |
p53 乙酰化
遇到 γ 射线和紫外线时,p300/CBP 和 P300/CBP 相关因子(PCAF)特异性乙酰化 p53;在 DNA 损伤情况下,TIP60 和 hMOF 乙酰化 p53。p53 的乙酰化可增强 p53与DNA 的结合,有助于招募共激活因子,并通过 MDM2 抑制其泛素化,从而稳定 p53 (Dai et al., 2010)。
p53 乙酰化研究工具:
氨基酸 | 推荐抗体 | 应用 |
K370 | Flow Cyt、ICC/IF、IP、WB | |
K373 | Flow Cyt、ICC/IF、IHC-P、WB | |
K381 | ELISA、ICC/IF、IHC-P、WB | |
K382 | Flow Cyt、ICC/IF、WB |
使用抗体组合套装,检测多种 p53 修饰以及突变 p53。该组合包含重组单克隆抗体,具有高特异性且批次间差异极小。
该组合(ab219089)中的抗体包括:
p53(p-S20)重组兔单抗[EPR2156(2)](ab157454)
p53(p-S46)重组兔单抗[EP42Y] (ab76242)
p53(p-S392)重组兔单抗[EP155Y] (ab33889)
p53(乙酰化 K382)重组兔单抗[EPR358(2)] (ab75754)
Bieging, K. T., Mello, S. S., & Attardi, L. D. (2014). Unravelling mechanisms of p53-mediated tumour suppression. Nature Reviews Cancer, 14(5), 359–370.
Clair, S. S., Giono, L., Varmeh-Ziaie, S., Resnick-Silverman, L., Liu, W. J., Padi, A., … Manfredi, J. J. (2004). DNA damage-induced downregulation of Cdc25C is mediated by p53 via two independent mechanisms: One involves direct binding to the cdc25C promoter. Molecular Cell, 16(5), 725–736.
Dai, C., & Gu, W. (2010). P53 post-translational modification: Deregulated in tumorigenesis. Trends in Molecular Medicine, 16(11), 528–536.
Inoue, T., Stuart, J., Leno, R., & Maki, C.G. (2002).Nuclear import and export signals in control of the p53-related protein p73. Journal of Biological Chemistry, 277(17), 15053–15060.
Khoury, M. P., & Bourdon, J. C.(2011).P53 isoforms: An intracellular microprocessor? Genes and Cancer, 2(4), 453–465.
Martín-Caballero, J., Flores, J. M., García-Palencia, P., & Serrano, M. (2001). Tumor Susceptibility of p21 Waf1/Cip1-deficient Mice 1. Cancer Research, 61, 6234–6238.
Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., & Zhang, R. (2013).The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research, 27(4), 254–271.
Pascual, M., Mena-Varas, M., Robles, E. F., Garcia-Barchino, M. J., Panizo, C., Hervas-Stubbs, S., … Roa, S. (2019).PD-1/PD-L1 immune checkpoint and p53 loss facilitate tumor progression in activated B-cell diffuse large B-cell lymphomas. In Blood (Vol. 133).
Perri, F., Pisconti, S., & Vittoria Scarpati, G. Della. (2016). P53 mutations and cancer: A tight linkage. Annals of Translational Medicine, 4(24), 2–5.
Wade Harper, J., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., & Elledge, S. J. (1993). The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell, 75(4), 805–816.
Wang, P., Reed, M., Wang, Y., Mayr, G., Stenger, J. E., Anderson, M. E., … Tegtmeyer, P. (1994). P53 Domains: Structure, Oligomerization, and Transformation. Molecular and Cellular Biology, 14(8), 5182–5191.
Williams, A. B., & Schumacher, B. (2016). p53 in the DNA-damage-repair process. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 6(5), 1–16.