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ELISA 疑难解答

为您的 ELISA 实验提供有效的解决方案。

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标准曲线较差

原因

解决方案

标准品溶液配置有误

确认是否进行正确稀释。

标准品复溶不当

开盖前进行离心;检查复溶后是否存在不溶物。

标准品已降解

按推荐方式保存和处理标准品。

曲线的标度不适合

尝试使用不同标度绘制曲线,例如双对数、5 参数拟合。

移液器加样误差

正确使用经过校准的移液器


无信号

原因

解决方案

孵育时间过短

样品在 4 ℃ 孵育过夜,或遵循试剂的实验方案。

靶标含量低于检测范围

减小样品的稀释倍数或浓缩样品。

样品类型不适用

对于没有验证过的样品类型,检测信号可能减弱或没有使用验证过的样品类型作为阳性对照同时进行检测。

抗原表位被孔板吸附,无法识别

使用直接或间接 ELISA 方法增强检测肽的能力,将肽偶联到大的载体蛋白上,然后包被到微量滴定板。

检测缓冲液的相容性

确保检测缓冲液与靶标兼容(例如,保留酶活性、保留蛋白质相互作用)。

检测试剂不足

遵循试剂的实验方案,增加检测试剂的浓度或用量。

样品制备不正确

确保进行正确的样品制备/稀释。样品可能与微量滴定板测定形式不兼容。

抗体不足

尝试不同的抗体浓度/稀释。

孵育温度过低

确保在正确温度下进行孵育。所有试剂(包括孔板)在进行实验前应处于室温,或试剂的实验方案所建议的温度。

波长不正确

确认波长,再次读板。

孔板被强力洗涤

检查并确保自动洗涤系统的压力正确。如果手动洗涤,则轻轻吸取冲洗缓冲液。

孔变干

测定开始后,不要让孔变干。将所有的孵育步骤使用封口膜或胶带密封孔板。

酶反应的显色速度慢

使用前配制底物溶液。确保母液未过期、未污染。延长孵育时间。


变异系数 (CV) 较大

原因

解决方案

孔中有气泡

读板前,确保不存在气泡。

孔洗涤不均/未充分洗涤

检查洗板机的所有管口是否畅通。使用推荐方法进行洗涤。

试剂混匀不充分

确保所有试剂充分混匀。

移液量不一致

正确使用经过校准的移液器

边缘效应

确保孔板和所有试剂处于室温。

样品制备或保存条件不一致

确保样品制备保持一致,使用最优的样品保存条件(例如尽可能减少反复冻融)。


背景偏高

原因

解决方案

孔洗涤不充分

按照实验方案建议进行洗涤。

洗涤缓冲液污染

制备新鲜的洗涤缓冲液。

检测试剂过多

确保试剂被正确稀释或者减少检测试剂的推荐浓度。

封闭缓冲液无效(例如检测试剂结合封闭剂;孔未完全封闭)

尝试不同的封闭剂和/或将封闭剂添加到洗涤缓冲液。

孵育/洗涤缓冲液的盐浓度

增加盐浓度可能会降低非特异性和/或减弱脱靶相互作用。

读板前加入终止液后时间太长

添加终止液后立即读板。

抗体出现非特异性结合

使用适当的封闭缓冲液,例如 BSA 或 5-10% 正常血清,如果是直标一抗,使用与一抗种属相同的血清,如果是非直标一抗,则使用与二抗种属相同的血清。确保孔已经过预处理,以防止非特异性附着。

高抗体浓度

尝试不同的稀释度,以获得最优结果。

底物孵育在光下进行

底物孵育应避光进行,或根据试剂的实验方案建议进行。

底物加入后孔中有沉淀生成

增大样品的稀释倍数或降低底物浓度。

孔板脏

清洁孔板底部。


灵敏度偏低

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原因

解决方案

ELISA 试剂盒保存不当

按推荐方式保存所有试剂。请注意,各试剂的保存条件可能有所不同。

靶标不足

浓缩样品或降低样品稀释度。

检测试剂失活

确保报告酶/荧光素具有预期的活性。

酶标仪设置不正确

在检测中,确保酶标仪设置为正确的吸收波长或激发/发射波长。

测定方法不够灵敏

更换更灵敏的检测系统(例如从比色检测转变为化学发光/荧光检测)。更换更灵敏的测定方法(例如从直接 ELISA 方法转变为夹心 ELISA 方法)。延长孵育时间或升高温度。

微量滴定板吸附靶标的效果不佳

将靶标共价结合到微量滴定板。

底物不足

加入更多底物。

样品类型不兼容(例如血清与细胞提取物)

对于没有验证过的样品种属,检测信号可能减弱或没有。使用验证过的样品类型作为阳性对照同时进行检测。

缓冲液或样品成分干扰

确认试剂中是否存在干扰性化合物。例如,抗体中的叠氮化钠会抑制 HRP 酶,在血浆中用作抗凝剂的 EDTA 会抑制酶反应。

混合或混用不同试剂盒的试剂

避免混合来自不同试剂盒的试剂。



基质效应

在使用 ELISA方法对血浆和血清进行定量时,偶尔会遇到基质效应所造成的问题。基质效应可能由多种基质组分引起,包括但不限于:内源性生物成分之间的相互作用,例如磷脂、碳水化合物和内源性代谢物(胆红素),或目标分析物与基质之间的相互作用,例如共价结合到血浆蛋白。这会导致错误的样品读值。

只需将样品稀释 2 至 5 倍即可降低基质效应。稀释样品时,注意应使用与标准曲线相同的稀释剂。